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皱纹盘鲍Δ5脂肪酸去饱和酶研究

作　者: 李明珠
导　师: 麦康森
学　校: 中国海洋大学
专　业: 水产养殖
关键词: 脂肪酸去饱和酶 植物油 长链多不饱和脂肪酸 鲍鱼
分类号: S917.4
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


本论文以皱纹盘鲍（Haliotis discus hannai Ino）为研究对象，对合成长链多不饱和脂肪酸（Long chain polyunsaturated fatty acid，LC-PUFA）的关键酶-Δ5脂肪酸去饱和酶（Δ5fatty acyl desaturase，Fad）展开相关研究。研究内容包括：Δ5Fad基因克隆、全长序列分析、基因功能验证和组织表达；同时研究了饲料中不同种类的脂肪酸（C18脂肪酸和LC-PUFA）以及不同梯度的底物脂肪酸对稚鲍存活、生长、肝胰腺和肌肉组织脂肪酸合成能力以及Δ5Fad基因表达的影响。1、大多数海水动物LC-PUFA的合成能力很差，主要是因为缺乏Δ5Fad基因或者Δ5去饱和活性偏低。然而，许多研究表明鲍鱼具有一定的以C18多不饱和脂肪酸（Polyunsaturated fatty acid，PUFA）为底物来合成LC-PUFA的能力。然而，关于鲍鱼LC-PUFA合成过程相关酶的研究以及分子调节机制还鲜有报道。本研究成功在皱纹盘鲍体内克隆到了Δ5Fad并对其进行了鉴定分析。研究结果表明，皱纹盘鲍体内存在两条Δ5Fad，Hdhfad1（GQ470626）和Hdhfad2（GQ466197）。Hdhfad1cDNA全长1530bp，开放阅读框编码一个由438个氨基酸组成的蛋白质，5’端包括99bp的非编码区，3’端包括114bp的非编码区。Hdhfad2全长1525bp，开放阅读框编码一个由439个氨基酸组成的蛋白，，5’端包括91bp的非编码区，3’端包括114bp的非编码区。Hdhfad1和Hdhfad2cDNA序列同源性高达96.82%，编码区氨基酸同源性高达96.58%。它们都具有front-end去饱和酶的显著结构特征，包括三个组氨酸保守区、细胞色素b5区的HPGG和跨膜结构。进化树分析显示，它们与章鱼Fad的进化关系最近。异源酵母表达分析表明Hdhfad1和Hdhfad2都具有Δ5去饱和功能，对n-3系底物脂肪酸20:4n-3的亲和力大于n-6系底物20:3n-6，并且Hdhfad1的去饱和活性高于Hdhfad2。Hdhfad1和Hdhfad2在鲍鱼肝胰腺和肠中表达较高，并且在所有检测组织中Hdhfad2的表达量均高于Hdhfad1。综上所述，鲍鱼体存在两条有功能的Δ5Fad（Hdhfad1和Hdhfad2），Hdhfad1的去饱和活性高于Hdhfad2，但其组织表达量低于Hdhfad2。本研究为进一步了解鲍鱼LC-PUFA合成能力提供了分子信息，为将来运用营养手段调节鲍鱼合成LC-PUFA奠定了分子基础。2、以体重为0.38±0.01g，壳长为15.06±0.21mm的皱纹盘鲍稚鲍为研究对象，在室内循环水养殖系统中进行为期120天的养殖试验，研究了饲料中的不同脂肪源对鲍鱼存活、生长、脂肪酸组成和Δ5Fad（Hdhfad1和Hdhfad2）基因表达的影响。实验采用6种不同的油脂作为饲料脂肪源配置精制饲料，包括富含16:0的棕榈酸甘油酯（Tripalmitin，TP）、富含18:1n-9的橄榄油（Olive Oil，OO）、富含18:2n-6葡萄籽油（Grape Seed Oil，GO）、富含18:3n-3的亚麻籽油（Linseed Oil，LO）、富含ARA的ARA油（ARA Oil，AO）以及富含EPA和DHA的EPA油（EPA Oil，EO）。每个处理3个重复，每个重复50头鲍鱼。结果表明：各组饲料对鲍鱼的存活率无显著影响，却显著影响了鲍鱼的生长。与对照TP处理组相比，OO（富含18:1n-9）、AO（富含ARA）和EO（富含EPA和DHA）饲料显著提高了鲍鱼的增重率（weight gain rate，WGR）、特定生长率（specific growth rate of weight，SGRW）、贝壳增长率（shell lengthincrease rate，SIR）、贝壳日增长率（daily growth rate of shell length，DGRSL）等生长指标（P<0.05）。GO饲料（富含18:2n-6）组鲍鱼的WGR、SGRW、SIR和DGRSL与对照组无显著差异（P>0.05）。LO饲料（富含18:3n-3）处理组鲍鱼的生长在所有处理组中最差。与对照组相比，OO饲料显著提高了鲍鱼肝胰腺和肌肉组织20:1n-9和22:1n-9的含量。GO饲料显著提高了鲍鱼n-6PUFA的含量，尤其是ARA。而LO饲料则显著提高了鲍鱼n-3PUFA的含量，尤其是EPA。AO和EO饲料则显著提高了鲍鱼体LC-PUFA的含量。基因表达分析表明，与对照组（TP）相比，LO饲料中富含的18:3n-3显著提高鲍鱼肝胰腺和肌肉组织Δ5Fads的表达，而饲料中富含的LC-PUFA，比如ARA、EPA和DHA等，显著降低了Δ5Fads的表达。Δ5Fads不受饲料中富含的18:1n-9和18:2n-6的调节。综上所述，鲍鱼具有以C18PUFA为底物合成LC-PUFA的能力，合成关键酶Δ5Fads的表达同时受到底物脂肪酸（18:3n-3）和产物脂肪酸（LC-PUFA）的调节。3、以体重为0.38±0.01g，壳长为15.06±0.21mm的皱纹盘鲍稚鲍为研究对象，在室内循环水养殖系统中进行为期120天的养殖试验，研究了饲料中的不同梯度植物油（富含18:2n-6的GO和富含18:3n-3的LO）对鲍鱼存活、生长、肝胰腺和肌肉脂肪酸组成以及Δ5Fads（Hdhfad1和Hdhfad2）基因表达的影响。实验制作7种精致饲料，分别含有0%、0.875%、1.5%和3.5%的GO或者LO为脂肪源。饲料脂肪不足3.5%的，添加TP补足到3.5%。TP饲料处理组鲍鱼为对照组。各组饲料分别命名为0%GO/LO（TP）、25%GO、50%GO、100%GO、25%LO、50%LO和100%LO。随着饲料中GO或者LO含量的不断增加，鲍鱼的生长指标（如特定生长率等）显著性的先上升后下降（R2>0.72, P=0.000）。各组鲍鱼的存活率不受饲料中GO（R2=0.04, P=0.815）或LO含量的显著影响（R2=0.50, P=0.046）。脂肪酸分析表明，随着GO饲料中18:2n-6的不断增加，鲍鱼肝胰腺和肌肉组织中18:2n-6、20:2n-6和22:2n-6的含量逐渐增加；肝胰腺中ARA的含量先上升后趋于平稳，而肌肉组织中ARA的含量逐渐增加。随着LO饲料中18:3n-3的不断增加，鲍鱼肝胰腺18:3n-3和20:3n-3的含量不断增加，EPA的含量先上升后趋于平稳，DPA和DHA的含量先上升后下降；肌肉组织中18:3n-3和20:3n-3的含量不断增加，EPA和DPA的含量先上升后保持平稳，DHA的含量则先上升后下降。与对照组相比，50%GO、50%LO和100%LO饲料显著提高了鲍鱼肝胰腺和肌肉组织Δ5Fads的表达量（P<0.05）。其他各组Δ5Fads的表达量与对照组无显著差异（P>0.05）。本研究表明底物脂肪酸18:2n-6和18:3n-3的梯度增加在一定范围内有助于提高鲍鱼Δ5Fads的表达并最终促进LC-PUFA的合成；过量添加会抑制LC-PUFA的合成，并影响鲍鱼生长。

全文目录


摘要  5-8
Abstract  8-11
目录  11-15
引言  15-18
第一章 综述  18-33
  0 前言  18-19
  1 脂肪酸去饱和酶的分类  19-20
  2 脂肪酸去饱和酶的空间构象  20-21
  3 脂肪酸去饱和酶的研究进展  21-31
    3.1 Δ6Fad 研究进展  21-29
      3.1.1 Δ6Fad 基因的克隆和组织表达  22
      3.1.2 Δ6Fad 基因的功能分析  22-23
      3.1.3 营养对Δ6Fad 基因表达的影响  23-27
      3.1.4 温度对Δ6Fad 基因表达的影响  27
      3.1.5 盐度对Δ6Fad 基因表达的影响  27
      3.1.6 其他因素对Δ6Fad 基因表达的影响  27-29
    3.2 Δ5Fad 研究进展  29-30
    3.3 Δ4Fad 研究进展  30-31
    3.4 Δ8Fad 研究进展  31
  4 小结  31-33
第二章 皱纹盘鲍Δ5Fad 的全长克隆、序列分析、功能验证和组织表达  33-72
  0 前言  33-34
  1 材料与方法  34-49
    1.1 实验试剂和材料  34-37
      1.1.1 实验仪器  34
      1.1.2 实验试剂  34-37
    1.2 实验方法  37-48
      1.2.1 Δ5Fad 基因全长克隆  37-42
        1.2.1.1 核心片段克隆  37-40
          1.2.1.1.1 Trizol 法提取鲍鱼肝胰腺组织 RNA  37
          1.2.1.1.2 简并引物设计  37-38
          1.2.1.1.3 cDNA 第一链合成  38-39
          1.2.1.1.4 核心片段 PCR 扩增  39
          1.2.1.1.5 目的片段 DHA 纯化  39
          1.2.1.1.6 目的片段连接和转化  39-40
          1.2.1.1.7 菌落鉴定  40
        1.2.1.2 Δ5Fad 3’ RACE  40-41
          1.2.1.2.1 3’ RACE 特异性引物设计与 cDNA 第一链合成  40-41
          1.2.1.2.2 3’ RACE PCR 反应  41
        1.2.1.3 Δ5Fad 5’ RACE  41-42
          1.2.1.3.1 5’ RACE特异性引物设计与 cDNA第一链合成  41
          1.2.1.3.2 5’ RACE PCR 反应  41-42
      1.2.2 Δ5Fad 全长序列分析  42
      1.2.3 Δ5Fad 功能验证  42-46
        1.2.3.1 Δ5Fad 基因全长高保真扩增  42-43
        1.2.3.2 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）真核表达载体的构建与检验  43-44
        1.2.3.3 重组表达载体转化酿酒酵母  44-45
          1.2.3.3.1 酵母感受态的制备  44
          1.2.3.3.2 表达质粒转化酵母感受态  44-45
          1.2.3.3.3 筛选阳性酿酒酵母  45
        1.2.3.4 蛋白诱导表达  45
        1.2.3.5 脂肪酸测定  45-46
          1.2.3.5.1 高效气相色谱仪测定脂肪酸  45-46
          1.2.3.5.2 高效气相质谱联用测定脂肪酸  46
        1.2.3.6 Δ5Fad 的转化效率  46
      1.2.4 Δ5Fad 在鲍鱼不同组织中的表达  46-48
        1.2.4.1 鲍鱼不同组织 RNA 提取和第一链 cDNA 合成  46-47
        1.2.4.2 普通 PCR 分析Δ5Fad 在鲍鱼不同组织中的表达  47
        1.2.4.3 2-ΔΔCT分析Δ5Fad 基因表达体系的建立与检测  47-48
          1.2.4.3.1 内参基因的选择及定量引物的检验  47-48
          1.2.4.3.2 退火温度及反应体积的筛选  48
        1.2.4.4 2-ΔΔCT分析鲍鱼不同组织的 Hdhfad1 和 Hdhfad2 的相对表达比率  48
    1.3 统计分析  48-49
  2 实验结果  49-69
    2.1 Δ5Fad 基因全长克隆  49-50
      2.1.1 鲍鱼肝胰腺组织总 RNA 质量检验  49
      2.1.2 Δ5Fad 基因核心片段、RACE 扩增结果  49-50
    2.2 Δ5Fad 基因全长序列分析  50-57
      2.2.1 Hdhfad1 和 Hdhfad2 全长 cDNA 序列分析  50
      2.2.2 Hdhfad1 和 Hdhfad2 编码区氨基酸一级结构分析  50-51
      2.2.3 Hdhfad1 和 Hdhfad2 编码区氨基酸二级结构分析  51-52
      2.2.4 Hdhfad1 和 Hdhfad2 编码区氨基酸亲疏水性和跨膜区分析  52-54
      2.2.5 Hdhfad1 和 Hdhfad2 与其他动物Δ5Fad 的编码区氨基酸多序列比对  54-55
      2.2.6 Hdhfad1 和 Hdhfad2 与其他动物△5Fad 编码区氨基酸同源性分析  55
      2.2.7 Hdhfad1 和 Hdhfad2 与其他动物 Fad 编码区氨基酸进化树分析  55-57
    2.3 Δ5Fad 基因功能验证  57-64
      2.3.1 Hdhfad1 和 Hdhfad2 cDNA 全长扩增  57
      2.3.2 Hdhfad1 和 Hdhfad2 表达载体的构建与检验  57-59
      2.3.3 Hdhfad1 和 Hdhfad2 功能验证结果  59-64
        2.3.3.1 气相色谱检测脂肪酸结果  59-60
        2.3.3.2 气相质谱联用检测脂肪酸结果  60
        2.3.3.3 HdhFad1 和 HdhFad2 转化效率  60-64
    2.4 相对定量分析Δ5Fad 基因的组织表达  64-69
      2.4.1 相对定量表达体系的建立和检验  64-68
        2.4.1.1 引物特异性验证  64-65
        2.4.1.2 目的基因与内参基因的扩增效率 E 验证  65-66
        2.4.1.3 退火温度与反应体积的确定  66-67
        2.4.1.4 SYBR Green Ⅰ定量 PCR 反应扩增曲线  67-68
      2.4.2 Hdhfad1 和 Hdhfad2 在不同组织中的表达  68-69
  3 讨论  69-71
  4 小结  71-72
第三章 饲料中不同脂肪源对稚鲍生长、脂肪酸合成能力以及Δ5Fad 基因表达的影响  72-88
  0 前言  72-73
  1 材料与方法  73-77
    1.1 实验饲料  73-75
    1.2 实验动物及管理  75-76
    1.3 样品的采集和处理  76
    1.4 样品分析  76-77
      1.4.1 生长指标的测定  76
      1.4.2 脂肪和脂肪酸含量的测定  76
      1.4.3 Δ5Fad 基因表达量的分析  76-77
    1.5 统计分析  77
  2 结果  77-84
    2.1 饲料中不同脂肪源对皱纹盘鲍稚鲍生长以及存活的影响  77-78
    2.3 饲料中不同脂肪源对稚鲍脂肪和脂肪酸组成的影响  78-82
    2.4 饲料中不同脂肪源对皱纹盘鲍稚鲍Δ5Fad 表达的影响  82-84
      2.4.1 不同脂肪源饲料对稚鲍内参基因表达量的影响  82-83
      2.4.2 不同脂肪源饲料对稚鲍Δ5Fad 表达量的影响  83-84
  3 讨论  84-87
  4 小结  87-88
第四章 不同梯度的植物油对鲍鱼生长、脂肪酸合成能力以及Δ5Fad 基因表达的影响  88-118
  0 前言  88-89
  1 材料与方法  89-93
    1.1 实验饲料  89-91
    1.2 实验动物及管理  91
    1.3 样品采集  91-92
    1.4 样品分析  92
      1.4.1 生长指标的测定  92
      1.4.2 脂肪和脂肪酸成分分析  92
      1.4.3 Δ5Fad 基因表达量的分析  92
    1.5 统计分析  92-93
  2 结果  93-114
    2.1 不同梯度植物油饲料对皱纹盘鲍稚鲍生长以及存活的影响  93-96
      2.1.1 GO 梯度添加饲料对稚鲍生长以及存活的影响  93
      2.1.2 LO 梯度添加饲料对稚鲍生长以及存活的影响  93-96
    2.2 不同梯度植物油饲料对皱纹盘鲍稚鲍脂肪和脂肪酸组成的影响  96-108
      2.2.1 GO 梯度添加饲料对稚鲍肝胰腺脂肪和脂肪酸组成的影响  96-99
      2.2.2 GO 梯度添加饲料对稚鲍肌肉组织脂肪和脂肪酸组成的影响  99-102
      2.2.3 LO 梯度添加饲料对稚鲍肝胰腺组织脂肪和脂肪酸组成的影响  102-105
      2.2.4 LO 梯度添加饲料对稚鲍肌肉组织脂肪和脂肪酸组成的影响  105-108
    2.4 不同梯度植物油饲料对皱纹盘鲍稚鲍Δ5Fad 表达的影响  108-114
      2.4.1 GO 梯度添加饲料对稚鲍Δ5Fad 表达的影响  108-111
        2.4.1.1 GO 梯度添加饲料对稚鲍内参基因表达量的影响  108-109
        2.4.1.2 GO 梯度添加饲料对稚鲍Δ5Fad 表达量的影响  109-111
      2.4.2 LO 梯度添加饲料对稚鲍Δ5Fad 表达的影响  111-114
        2.4.2.1 LO 梯度添加饲料对稚鲍内参基因表达量的影响  111-112
        2.4.2.2 LO 梯度添加饲料对稚鲍Δ5Fad 表达量的影响  112-114
  3 讨论  114-117
  4 小结  117-118
第五章 全文总结  118-119
参考文献  119-136
附录  136-140
致谢  140-141
个人简历  141-142
研究成果  142-143

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