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犬瘟热病毒单克隆抗体夹心ELISA方法的建立与胶体金免疫层析试纸条的制备

作　者: 王智群
导　师: 张海彬; 王永山
学　校: 南京农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 犬瘟热病毒 单克隆抗体 夹心ELISA 胶体金免疫层析试纸条 检测
分类号: S858.292
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
下　载: 27次
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内容摘要


犬瘟热(Canine Distemper, CD)是犬等肉食动物中的一种高度接触性、致死性传染病,是危害犬养殖业、毛皮动物养殖业及野生动物保护业最严重的疫病之一。本实验旨在建立犬瘟热病毒单克隆抗体夹心ELISA方法、制备胶体金免疫层析试纸条,适用于临床犬瘟热病毒的快速检测。实验内容包括两部分：实验一：将分泌犬瘟热病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株1D7和3H11,分别腹腔注射BALB/c小鼠,制备单克隆抗体腹水,纯化并鉴定。将单克隆抗体3H11加以辣根过氧化物酶标记,以单抗1D7作为包被抗体,以酶标抗体3H11作为检测抗体,建立检测犬瘟热病毒的单克隆抗体夹心ELISA方法。对最佳工作条件进行了优化,最终确定：单抗1D7的包被浓度为20μg/mL,包被最佳条件为4℃过夜,最佳封闭液为5%的脱脂奶粉,酶标抗体工作浓度为1：4000。包被的犬瘟热抗体与犬细小病毒(CPV)、犬冠状病毒(CCV)、犬副流感病毒(CPIV)、犬腺病毒Ⅰ型(CAV-I)等无交叉反应；建立双抗夹心ELISA方法可以检测到的最低病毒含量为102TCID50/mL;板内和板间变异系数在0.5%-6.3%之间；对50份临床样品检测并与商品试剂盒比较,两者共同符合率为92%。以上试验结果表明建立的犬瘟热病毒双抗体夹心ELISA检测方法具有特异性强、敏感度高、重复性好等优点。实验二：采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金,标记纯化的单抗3H11,制备金标抗体玻璃纤维素膜；将纯化的单抗1D7作为捕获抗体,固定于硝酸纤维素膜(NC)上,制备胶体金免疫层析检测试纸条。对最佳工作条件进行了优化,最终确定：胶体金标记抗体3H11的最佳浓度为17gg/mL,标记最佳pH值为8.0；包被于NC膜的抗体1D7浓度为2.0mg/mL。制备的胶体金免疫层析检测试纸条不与犬细小病毒(CPV)、犬冠状病毒(CCV)、犬副流感病毒(CPⅣ)、犬腺病毒(CAV-1)等发生交叉反应；敏感性试验结果表明,试纸条可以检测到的最低病毒含量为103TCID50/mL,灵敏性稍低于双抗体夹心ELISA方法；不同批次试纸条对样品的检测结果一致；4℃和25℃条件下可以保存6个月。以上试验结果表明制备的试纸条具有较高的特异性、敏感性和稳定性,1-5min内即可得出检测结果,便于CDV的临床快速诊断与样品现场检测。

全文目录


摘要  6-8
ABSTRACT  8-10
缩略符号  10-11
第一章 文献综述  11-23
  1 犬瘟热的病原学特征  11-12
    1.1 犬瘟热的分类  11
    1.2 犬瘟热病毒的理化特性  11-12
  2 犬瘟热的流行病学特征  12-13
    2.1 传染源  12
    2.2 传播途径  12
    2.3 易感动物和流行季节  12-13
  3 犬瘟热的临床症状及其病理变化  13-14
    3.1 临床症状  13
    3.2 病理变化  13-14
  4 犬瘟热病毒分子生物学研究进展  14-16
    4.1 核衣壳蛋白(N)  14-15
    4.2 磷蛋白(P)  15
    4.3 融合蛋白(F)  15
    4.4 基质膜蛋白(M)  15
    4.5 附着或血凝蛋白(H)  15-16
    4.6 大蛋白(L)  16
  5 犬瘟热诊断研究进展  16-20
    5.1 病毒的分离鉴定  16
    5.2 免疫学检查方法  16-19
    5.3 分子生物学诊断方法  19-20
    5.4 其它试验室方法  20
  6 预防和治疗  20-23
    6.1 预防  20-21
    6.2 治疗  21-23
第二章 犬瘟热病毒单克隆抗体夹心ELISA方法的建立  23-37
  摘要  23
  1 材料与方法  23-27
    1.1 材料  23-24
    1.2 方法  24-27
  2 结果  27-33
    2.1 单克隆抗体腹水的制备与纯化  27-28
    2.2 酶标抗体效价和工作浓度的确定  28-29
    2.3 双抗体夹心ELISA方法的建立  29-31
    2.4 夹心ELISA性能评定  31-33
  3 讨论  33-36
    3.1 关于腹水的生产  33-34
    3.2 关于单克隆抗体的纯化  34
    3.3 关于ELISA条件的优化  34-36
  4 小结  36-37
第三章 犬瘟热病毒胶体金免疫层析试纸条的制备  37-47
  摘要  37
  1 材料与方法  37-40
    1.1 材料  37-38
    1.2 方法  38-40
  2 结果  40-43
    2.1 胶体金溶液的制备  40
    2.2 免疫胶体金的制备  40-41
    2.3 胶体金免疫层析试纸条的制备  41-42
    2.4 胶体金免疫层析检测试纸条检验  42-43
  3 讨论  43-45
    3.1 本研究制备的试纸条的设计原理  43-44
    3.2 胶体金的制备  44
    3.3 胶体金pH值的调节  44
    3.4 胶体金标记最佳pH值的确定  44-45
    3.5 胶体金标记蛋白最佳浓度的确定  45
    3.6 胶体金标记蛋白的要求  45
  4 小结  45-47
参考文献  47-53
全文总结  53-55
致谢  55-57
攻读学位期间发表的学术论文目录  57

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 各种家畜、家禽、野生动物的疾 > 家畜 > 犬
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