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犊牛腹泻轮状病毒分离鉴定及RT-LAMP检测方法的建立

作　者: 李巍
导　师: 孙继国
学　校: 河北农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 牛轮状病毒分离鉴定环介导等温扩增技术检测
分类号: S858.23
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

轮状病毒(Bovine Rotavirus, BRV)属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)轮状病毒属(Rotavirus),是引起各种幼龄动物病毒性腹泻的主要病原之一。该病自报道以来,已在全世界主要养牛国家普遍发生和流行,给养牛业造成严重的经济损失。常用检测方法有RT-PCR,ELISA等,可由于需要昂贵的设备和专业人员而不便于在临床普遍应用,所以急需一种方便简单的检测方法。环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)通过具有链置换特性的Bst DNA聚合酶完成靶序列的扩增,仅需恒温就能扩增核酸,并可通过核酸染料染色或者离心沉淀观察结果,较之普通的RT-PCR方法,具有简便、快速的特点。对保定地区发病牛场的犊牛腹泻病料进行处理,得到疑似病毒液,然后将其接种到Marc-145细胞上,37℃CO2条件下盲传四代后,细胞出现皱缩、变圆、界限不清晰、崩解等病变。根据GenBank发表的牛轮状病毒VP7基因序列,设计了一对特异性引物。用此引物对出现细胞病变的培养液进行RT-PCR检测,所得目的片段与预期片段长度(342bp)一致。将RT-PCR产物纯化回收,进行克隆转化及序列测定,分析结果与预期的结果相同。对该毒株的理化特性鉴定结果表明:该株牛轮状病毒不耐热,对氯仿、强酸、乙醚有良好的抵抗力。证实本研究分离出的病毒为牛轮状病毒,命名为BD株。本研究将建立检测BRV的RT-LAMP检测方法。根据GenBank中发表的BRV基因序列,用DNAstar进行分析和比对后发现,VP7的基因序列相对保守,故针对VP7进行引物设计。利用Primer Explorer4.0引物设计软件,严格按照引物设计原则及注意事项进行引物设计,并对设计出的引物进行筛选,最终确定一组,包括外引物F3、B3,内引物FIP、BIP。用此引物对提取好的病毒RNA进行RT-LAMP反应,并对试验反应条件进行优化。结果表明,RT-LAMP最佳反应温度是62℃,反应时间为50min;优化的各组分浓度分别为:Mg2+ 2.5μL,dNTPs 3.5μL,Bst DNA聚合酶1.5μL;外引物和内引物最佳浓度比为1:6,即外引物(F3:B3=1:1)共计为1μL,内引物(FIP:BIP=1:1)共计为6μL。对经过摸索条件后建立的反应体系进行灵敏度、特异性、重复性和稳定性试验,结果表明,RT-LAMP的敏感性是RT-PCR的100倍;特异性试验结果显示无交叉反应存在,说明该检测技术特异性较好;批间和批内的检测结果无明显差异,说明该检测方法相对稳定,重复性较好。用本试验建立的RT-PCR和RT-LAMP方法对49份样品提取的RNA进行检测后,结果表明两种方法的符合率达到100%。本研究成功建立了BRV的RT-LAMP检测技术。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-10
1 引言  10-29
  1.1 犊牛腹泻轮状病毒的研究现状  10-19
    1.1.1 病原学  10-15
    1.1.2 流行病学  15-16
    1.1.3 病因与发病机理  16-17
    1.1.4 轮状病毒的检测方法  17-19
  1.2 环介导等温扩增技术（LAMP 技术）  19-27
    1.2.1 LAMP 技术的概述  19
    1.2.2 LAMP 技术的基本原理  19-24
    1.2.3 LAMP 的特点  24-25
    1.2.4 LAMP 技术的应用  25-27
  1.3 研究目的及意义  27
  1.4 研究内容及技术路线  27-29
    1.4.1 研究内容  27-28
    1.4.2 技术路线  28-29
2 材料与方法  29-43
  2.1 材料  29-35
    2.1.1 病料及毒株  29
    2.1.2 细胞、菌种与质粒载体  29
    2.1.3 主要仪器  29-30
    2.1.4 实验所需主要试剂  30-31
    2.1.5 试验所需主要溶液及其配制  31-33
    2.1.6 引物的设计与合成  33-35
  2.2 方法  35-43
    2.2.1 牛轮状病毒的分离鉴定  35-40
    2.2.2 犊牛腹泻轮状病毒RT-LAMP 检测方法的建立  40-43
3 结果  43-52
  3.1 犊牛腹泻轮状病毒的分离鉴定  43-45
    3.1.1 病毒的细胞分离培养  43
    3.1.2 细胞毒的RT-PCR 检测结果  43-44
    3.1.3 PCR 产物的克隆与序列测定  44
    3.1.4 分离毒株的毒力测定-- TCID50 的测定  44
    3.1.5 病毒的理化特性结果  44-45
  3.2 犊牛腹泻轮状病毒RT-LAMP 快速检测方法的建立  45-52
    3.2.1 RT-LAMP 扩增反应结果  45-46
    3.2.2 RT-LAMP 扩增产物的酶切鉴定  46
    3.2.3 RT-LAMP 扩增反应条件的优化  46-49
    3.2.4 RT-LAMP 检测方法的特异性检测  49-50
    3.2.5 RT-LAMP 与RT-PCR 的灵敏性检测  50-51
    3.2.6 RT-LAMP 扩增方法重复性和稳定性的检测  51
    3.2.7 RT-LAMP 检测方法的应用  51-52
4 讨论  52-56
  4.1 犊牛腹泻轮状病毒的分离鉴定  52-53
    4.1.1 犊牛腹泻轮状病毒的分离与培养  52
    4.1.2 病毒的特性  52
    4.1.3 犊牛腹泻轮状病毒的鉴定  52-53
  4.2 犊牛腹泻轮状病毒RT-LAMP 快速检测方法的建立  53-56
    4.2.1 RT-LAMP 反应体系的分析  53
    4.2.2 RT-LAMP 产物的检测  53-54
    4.2.3 RT-LAMP 操作过程中假阳性问题  54-55
    4.2.4 RT-LAMP 检测方法与其它检测方法的比较  55
    4.2.5 RT-LAMP 方法的进一步研究  55-56
5 结论  56-57
参考文献  57-62
附录A  62-63
在读期间发表论文  63-64
作者简介  64-65
致谢  65-66

犊牛腹泻轮状病毒分离鉴定及RT-LAMP检测方法的建立

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