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传染性法氏囊病病毒VP2与C3d串联基因重组表达质粒的构建及其免疫功能分析

作　者: 马金荣
导　师: 张海彬; 王永山
学　校: 南京农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: IBDV 鸡补体C3d 传染性法氏囊病病毒VP2基因 PEI N/P比值 免疫保护率
分类号: S858.31
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


传染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease, IBD)是由传染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus, IBDV)引起的起的鸡的一种高度接触性传染病,以侵害雏鸡法氏囊损伤为主要特征的传染病。鸡孵出后3-6周,法氏囊发育成熟,此时是IBDV的易感期。鸡感染IBDV后,机体出现免疫抑制,IBDV在法氏囊的B淋巴细胞中繁殖同时损伤B淋巴细胞,导致疫苗免疫接种失败和继发感染的发生,造成动物死亡。预防该病最有效的方法是接种疫苗,但是毒株的变异和强毒株的出现造成免疫失败。目前,针对IBD的疫苗有活疫苗和灭活疫苗,前者因不同IBDV毒株之间潜在着基因重配的可能,使其存在着较大的生物安全问题,给该病的防控带来隐患；而灭活疫苗有制备困难以及免疫效果低下等问题。因此,此病仍然流行,对养鸡业造成严重的经济损失。为此,当前禽病防控工作中亟待解决的重要课题为研制新型IBDV基因工程疫苗,提高免疫效力。本研究内容包括以下三个部分：试验1：传染性法氏囊病病毒VP2与C3d串联基因重组表达质粒的构建及其在真核细胞中的表达为了提高传染性法氏囊病病毒(IBDV) VP2基因核酸疫苗的免疫效力,根据已发表的鸡源C3d序列,设计在5’端添加连接肽(Gly4Ser)2序列的C3d基因,合成并克隆到pUC57载体中。用同尾酶BglⅡ和BamHⅠ构建含有1-3拷贝C3d的重组表达质粒pcDNA-C3d、pcDNA-2C3d、pcDNA-3C3d,将IBDV VP2基因定向插入到1-3拷贝C3d基因的3’端,获得含VP2与1-3拷贝C3d串联基因的重组真核表达质粒pcDNA-VP2-C3d、pcDNA-VP2-2C3d、pcDNA-VP2-3C3d。将3种质粒用脂质体法转染BHK21细胞,间接免疫荧光试验(IFA)检测,均具有特异性荧光,用蛋白免疫印迹(Western blot)分析,pcDNA-VP2-C3d转染后出现一条分子量约84ku的蛋白带,与VP2-C3d重组蛋白的分子量理论值相符合；pcDNA-VP2-2C3d转染后出现一条分子量约124ku的蛋白带,与VP2-2C3d重组蛋白的分子量理论值相符合；pcDNA-VP2-3C3d转染后出现一条分子量约162ku的蛋白带；与VP2-3C3d重组蛋白的分子量理论值相符合,表明VP2与含有不同拷贝C3d的重组表达质粒均能够并在真核细胞中正确表达,为研制以鸡补体C3d为分子佐剂的免疫增强型IBD VP2基因核酸疫苗奠定了基础。试验2：分子佐剂C3d对鸡传染性法氏囊病病毒VP2核酸疫苗的免疫功能的影响为了研究不同拷贝分子佐剂c3d对IBD VP2基因免疫功能的影响,本实验将pcDNA-VP2、pcDNA-VP2-C3d、pcDNA-VP2-2C3d、pcDNA-VP2-3C3d与空载体分别免疫SPF鸡,14日龄首免,免疫两次,间隔两周,二免后14d用IBDV标准强毒株Bc6/85攻击。二免后14d,ELISA方法测其抗体效价,pcDNA-VP2-3C3d、 pcDNA-VP2-2C3d诱导的抗体水平显著高于pcDNA-VP2组；中和试验检测抗IBDV血清中和效价,pcDNA-VP2-3C3d组效价显著高于pcDNA-VP2组,pcDNA-VP2-C3d、pcDNA-VP2-2C3d组效价高于pcDNA-VP2组差异不显著；硫氰酸盐洗脱法检测抗体亲和力水平,pcDNA-VP2-3C3d的抗体亲和力指数为高于pcDNA-VP2、pcDNA-VP2-C3d、pcDNA-VP2-2C3d诱导的抗体亲和力；MTT法检测淋巴细胞增殖水平,pcDNA-VP2-3C3d诱导的刺激指数显著高于pcDNA-VP2组,pcDNA-VP2-C3d、pcDNA-VP2-2C3d诱导的刺激指数高于pcDNA-VP2组,但差异不显著(p<0.05)。攻毒后4,5d出现死亡,攻毒空质粒及空白对照鸡全部发病死亡。pcDNA-VP2-3C3d、pcDNA-VP2-2C3d、pcDNA-VP2-C3d、pcDNA-VP2组的免疫保护率分别为70.0%,63.33%,56.67%,46.67%。pcDNA-VP2-3C3d、pcDNA-VP2-3C3d组的免疫保护率显著高于pcDNA-VP2组,pcDNA-VP2-2C3d、pcDNA-VP2-C3d组的免疫保护率均高于pcDNA-VP2组差异不显著(p<0.05)。结果说明,分子佐剂C3d提高了VP2基因疫苗诱导的抗体水平,加速了抗体亲和力成熟,促进细胞免疫的增强,并可部分抵抗IBDV强毒BC6/85的攻击。1～3拷贝的c3d均可不同程度地增加VP2基因核酸疫苗的免疫效果,其中3拷贝分子佐剂C3d的免疫增强能力最显著。试验3：聚乙烯亚胺介导的pcDNA-VP2-3C3d重组真核表达质粒免疫效果聚乙烯亚胺(polyethylenimine, PEI)是一种新型阳离子多聚物基因释放载体,可结合浓缩DNA,通过粘附内吞,进入细胞,使携带的质粒表达。为了进一步提高pcDNA-VP2-3C3d的免疫效果,pcDNA-VP2-3C3d与PEI分别按4、6、8、10的NH4+/PO3-比州/P)混合,命名为VP2-3C3d-4、VP2-3C3d-6、VP2-3C3d-8、VP2-3C3d-10免疫组,分别免疫SPF鸡,免疫两次。二免后14d用IBDV标准强毒株BC6/85攻击。ELISA方法测其抗体效价,二免后14d,VP2-3C3d-4免疫组的特异性抗IBDV水平与pcDNA-VP2-3C3d组相同；N/P值为6和8的免疫组的抗体效价显著高于pcDNA-VP2-3C3d组；N/P值为10的抗体效价低于pcDNA-VP2-3C3d组(p<0.05)。中和试验检测中和效价,结果与ELISA方法测得结果一致。二免后14d用IBDV标准强毒株BC6/85攻击,VP2-3C3d-4、VP2-3C3d-6、VP2-3C3d-8、 VP2-3C3d-10、pcDNA-VP2-3C3d组存活率分别达到66.67%、90.00%、93.33%、60.00%、77.33%,VP2-3C3d-6、VP2-3C3d-8组存活率显著高于pcDNA-VP2-3C3d组(p<0.05)。攻毒空质粒及空白对照组攻毒后鸡全部发病死亡。结果表明PEI能提高pcDNA-VP2-3C3d的免疫效力。

全文目录


摘要  8-11
ABSTRACT  11-15
缩略语表（Abbreviation)  15-16
第一篇 文献综述  16-38
  第一章 传染性法氏囊病的疫苗研究进展  16-24
    1 IBDV概述  16-17
    2 IBDV的基因组结构及蛋白功能  17-19
      2.1 IBDV的基因组结构组成  17-18
      2.2 病毒蛋白及其功能  18-19
    3 IBDV疫苗的研究  19-22
      3.1 常规疫苗  19
      3.2 基因工程疫苗  19-22
    参考文献  22-24
  第二章 DNA疫苗研究进展  24-38
    1 DNA疫苗的概念  24
    2 DNA疫苗的作用机制  24-25
    3 DNA疫苗的特点  25-26
    4 影响DNA疫苗免疫效果的因素  26-34
      4.1 载体的选择  26
      4.2 目的基因的选择  26-27
      4.3 接种途径  27
      4.4 接种剂量和次数  27
      4.5 DNA疫苗的免疫增强机制  27-34
    参考文献  34-38
第二篇 试验研究  38-76
  第一章 传染性法氏囊病病毒VP2与C3d串联基因重组真核表达质粒的构建及其在细胞中的表达  38-52
    摘要  38-39
    1 材料与方法  39-43
      1.1 菌株、质粒和细胞  39
      1.2 主要试剂  39
      1.3 鸡源C3d基因的设计与合成  39-40
      1.4 1～3个拷贝C3d串联体的构建  40
      1.5 IBDV VP2真核表达质粒的构建  40-41
      1.6 VP2与C3d串联基因真核表达质粒的构建  41
      1.7 VP2基因与1～3C3d基因真核表达质粒在BHK21中的表达  41-43
    2 结果  43-46
      2.1 1～3个拷贝C3d串联基因体的构建  43
      2.2 IBDV VP2真核表达质粒的构建  43
      2.3 VP2与C3d串联基因真核表达质粒的构建  43-44
      2.4 Western blot分析  44-45
      2.5 IFA检测  45-46
    3 讨论  46-47
    4 小结  47-48
    参考文献  48-50
    Abstract  50-52
  第二章 分子佐剂C3d对鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因免疫功能的影响  52-66
    摘要  52-53
    1 材料与方法  53-56
      1.1 主要材料  53
      1.2 试验动物  53
      1.3 pcDNA-VP2-1～3C3d的制备  53
      1.4 动物分组与免疫  53-54
      1.5 免疫保护效果的观察  54-56
    2 结果  56-59
      2.1 间接ELISA检测IBDV抗体  56
      2.2 中和试验  56-57
      2.3 抗体亲和力的检测  57-58
      2.4 淋巴细胞增殖实验  58
      2.5 攻毒保护实验  58-59
    3 讨论  59-61
    4 小结  61-62
    参考文献  62-64
    Abstract  64-66
  第三章 聚乙烯亚胺介导的重组真核表达质粒pcDNA-VP2-3C3d免疫效果  66-76
    摘要  66-67
    1 材料与方法  67-69
      1.1 主要材料  67
      1.2 试验动物  67
      1.3 DNA/PEI复合物的制备  67
      1.4 动物分组与免疫  67-68
      1.5 免疫保护效果的观察  68-69
      1.6 统计学分析  69
    2 结果  69-70
      2.1 间接ELISA检测IBDV抗体  69
      2.2 中和试验  69-70
    3 讨论  70-72
    4 小结  72-73
    参考文献  73-75
    Abstract  75-76
全文总结  76-78
附录：常用试剂的配制  78-82
致谢  82-84
攻读学位期间发表的学术论文  84

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 各种家畜、家禽、野生动物的疾 > 家禽 > 鸡
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