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检测奶牛宫颈粘液抗精子抗体的相关研究

作　者: 马瑛
导　师: 高庆华
学　校: 塔里木大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 抗精子抗体宫颈粘液奶牛不孕
分类号: S823
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

奶牛免疫不孕严重影响奶牛正常繁殖,相对于其他不孕类型不容易被确诊,准确对孕牛与不孕牛之间宫颈粘液抗精子抗体(ASA)的差异进行定性和定量分析,对奶牛免疫不孕的治疗研究有重要的意义。本研究对不孕和可孕奶牛宫颈粘液进行SDS-PAGE、Western blot和双向电泳分析,并建立奶牛宫颈粘液ASA免疫不孕的间接ELISA检测方法。研究结果如下：1.建立一种分离奶牛宫颈粘液的SDS-PAGE有效方法,优化条件为：8%分离胶,15μL上样量,100V,电泳3-4h。SDS-PAGE分离奶牛宫颈粘液得到分子量为22-25KD蛋白,初步确定为ASA轻链,24头不孕奶牛的宫颈粘液中全部存在ASA轻链(100%),在14头可孕奶牛中只有2头奶牛的宫颈粘液中存在ASA轻链(14.2%),而且ASA轻链在可孕牛宫颈粘液含量明显低于不孕牛的。2.免疫印迹试验结果显示不孕奶牛宫颈粘液ASA对分子量为88-90KD、66KD、55-57KD、25-27KD的精子膜抗原有特殊免疫性反应,识别抗原率为100%(24/24)、100%(24/24)、87.5%(21/24)、70.8%(17/24)；而可孕奶牛宫颈粘液ASA的识别率仅为21.4%(3/14)、0%(0/14)、14.2%(2/14)、14.2%(2/14)。3.建立检测奶牛宫颈粘液ASA免疫不孕的间接ELISA方法,最佳反应条件为：精子膜抗原浓度为5μg/mL,被检宫颈粘液稀释度为1：5,宫颈粘液孵育时间为1h,酶标二抗作用时间为1.5h。确定奶牛ASA免疫不孕检测的判定标准,当样品OD490nm大于0.513时,判定为ASA阳性免疫不孕,当样品OD490nm小于0.410时,判定为可孕,当样品OD490nm介于0.513和0.410之间时,判定为ASA阳性疑似。该法对6种疾病性不孕奶牛的宫颈粘液进行检测,均未发现交叉反应,表明该方法特异性强；批内和批间重复试验的变异系数分别在4.39%-9.31%和4.08%-9.96%之间。和TAT法相比较,间接ELISA法的符合率、敏感性和特异性分别为97.8%、100%和97.6%。4.利用双向电泳技术分析不孕奶牛和可孕奶牛宫颈黏中的差异蛋白。当不孕奶牛宫颈粘液蛋白上样量分别为0.8、1.6mg时,0.8mg蛋白上样量较少,电泳图谱中各个蛋白点较小,且不清晰；而1.6mg蛋白电泳图谱各个蛋白点显得大、浓。当可孕和不孕奶牛宫颈粘液蛋白上样量均为1.6mg时,可孕奶牛和不孕奶牛宫颈粘液蛋白双向电泳图谱分别获得蛋白斑点数67个和151个,不孕奶牛宫颈粘液蛋白质斑点数明显多于可孕奶牛的。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-10
第一章文献综述  10-19
  1.0 奶牛 ASA 研究意义  10
  1.1 ASA 产生机制  10-11
  1.2 ASA 类型  11-12
    1.2.1 IgG 型 ASA  11-12
    1.2.2 IgA 型 ASA  12
    1.2.3 IgM 型 ASA  12
  1.3 ASA 对生殖的影响  12-14
    1.3.1 ASA 对精子运输作用的影响  12-13
    1.3.2 ASA 对精子获能和顶体反应的影响  13
    1.3.3 ASA 对精子-卵母细胞作用的影响  13-14
    1.3.4 ASA 对局部免疫的影响  14
  1.4 ASA 检测方法  14-16
    1.4.1 凝集试验（AT）  15
    1.4.2 免疫珠试验（IBT）  15
    1.4.3 混和抗球蛋白反应（Mar test）  15
    1.4.4 酶联免疫吸附试验（ELISA）  15-16
    1.4.5 精子制动试验（SIT）  16
    1.4.6 流式细胞仪（FCM）检测技术  16
  1.5 ASA 免疫不孕的治疗和预防  16-17
    1.5.1 免疫隔绝疗法  16
    1.5.2 免疫抑制疗法  16-17
    1.5.3 中医中药疗法  17
    1.5.4 辅助生殖技术  17
    1.5.5 实验室技术  17
  1.6 研究目的  17-19
    1.6.1 建立 SDS-PAGE 快速分离检测奶牛宫颈粘液蛋白的有效方法  17
    1.6.2 对比免疫性不孕和可孕奶牛宫颈粘液 ASA 识别精子膜抗原差异  17
    1.6.3 建立检测奶牛宫颈粘液 ASA 免疫不孕的间接 ELISA 方法  17-18
    1.6.4 2-D 电泳分析不孕奶牛和可孕奶牛宫颈粘液差异蛋白  18-19
第二章 SDS-PAGE 分离不孕奶牛宫颈粘液 ASA  19-26
  2.1 材料与方法  19-22
    2.1.1 材料  19-21
    2.1.2 方法  21-22
  2.2 结果与分析  22-23
    2.2.1 SDS-PAGE 最适条件的建立  22
    2.2.2 SDS-PAGE 分离不孕牛奶牛和可孕奶牛宫颈粘液  22-23
  2.3 讨论  23-25
  2.4 小结  25-26
第三章不孕奶牛宫颈粘液相关 ASA 免疫印迹分析  26-32
  3.1 材料与方法  26-28
    3.1.1 材料  26-27
    3.1.2 实验方法  27-28
  3.2 结果与分析  28-30
    3.2.1 不孕和可孕奶牛宫颈粘液 Western blot 分析  28-30
  3.3 讨论  30-31
  3.4 小结  31-32
第四章奶牛宫颈粘液抗精子抗体免疫不孕的间接 ELISA 检测  32-41
  4.1 材料与方法  32-36
    4.1.1 材料  32-33
    4.1.2 方法  33-36
  4.2 结果  36-39
    4.2.1 Bradford 法检测精子膜蛋白含量的结果  36
    4.2.2 抗原和宫颈粘液最佳稀释度的选择  36
    4.2.3 宫颈粘液最适作用时间的选择  36-37
    4.2.4 酶标抗体最适作用时间的选择  37
    4.2.5 奶牛宫颈粘液 ASA 免疫不孕界限标准的判定  37-38
    4.2.6 敏感性试验结果  38
    4.2.7 特异性试验结果  38
    4.2.6 重复性实验结果  38
    4.2.7 临床奶牛宫颈粘液 ASA 免疫不孕症检测结果  38-39
  4.3 讨论  39-40
  4.4 小结  40-41
第五章不孕奶牛与健康奶牛宫颈粘液蛋白表达图谱的初步分析  41-49
  5.1 材料和方法  41-44
    5.1.1 材料  41-42
    5.1.2 方法  42-44
  5.2 结果与分析  44-46
    5.2.1 处理宫颈粘液总蛋白的 SDS-PAGE 电泳结果  44-45
    5.2.2 不同上样量双向电泳结果的比较  45-46
    5.2.3 可孕和不孕奶牛宫颈粘液双向电泳差异比较  46
  5.3 讨论  46-48
  5.4 小结  48-49
结论  49-50
参考文献  50-55
附录  55-56
致谢  56-57
作者简介  57

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