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利用cDNA阵列筛选橡胶树抗寒相关基因的研究

作　者: 张燕燕
导　师: 黄华孙
学　校: 海南大学
专　业: 林木遗传育种
关键词: 巴西橡胶树抗寒地高辛标记 cDNA阵列
分类号: S794.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

低温是影响橡胶生长和产量的重要环境限制因子。我国植胶区位于北纬18°至24°,是世界植胶区的最北端,低温寒害几乎每年都会发生。近几年生产上遭受的寒潮袭击,导致橡胶大面积减产,给橡胶生产带来巨大损失甚至是毁灭性的危害。因此,橡胶抗寒育种工作在橡胶抗逆育种中是首要的研究内容。植物的抗寒性状是由多基因控制的,只有成簇抗性相关基因的转录激活,才能有效提高作物的抗寒能力。但在植物的抗寒研究中,只有拟南芥的CBF途径研究最清楚并得到广泛的认可,而抗寒基因表达调控机制、编码蛋白质的抗寒机理及整个低温调控网络仍不明了,这样就极大的限制了植物抗寒育种工作。利用植物分子生物学技术来提高植物的抗寒、抗旱能力的研究进展十分迅速。本研究通过cDNA阵列的方法,从巴西橡胶树低温cDNA文库中筛选橡胶冷应答基因调控网络中的一些抗寒相关基因,分析其功能及各个基因之间的相互关系。内容概括如下：1在低温胁迫下,共检测到84条差异表达的基因。在抗性与敏感品种对比中共检测到21条差异表达的基因。低温启动诱导了相当部分的基因上调表达,这些基因大部分是和基本的新陈代谢相关,此外还有细胞过程和信号传导相关的基因。初步获得了橡胶树低温胁迫下基因表达谱。2进一步分析最终筛选出在低温下差异表达的抗寒相关基因：转录因子(锌指蛋白基因、MYB)、蛋白质合成降解相关的泛素、26s蛋白酶体,过氧化物酶体腺苷酸载体基因、能量代谢相关半乳糖-1-磷酸尿苷转移酶。3在本实验中,还检测到一些在低温胁迫下存在表达变化的“假想蛋白”和未定名的蛋白。这些蛋白在低温胁迫过程中有上调表达的也有下调表达的,可能执行某种生物学功能,有的蛋白可能在抗非生物胁迫中具有重要的作用。4利用高通量的基因芯片技术,在基因转录水平分析了低温胁迫下橡胶树基因的表达差异,并初步分析了部分低温下上调表达的基因。为研究橡胶树抗寒胁迫的分子机理打下基础及大量克隆橡胶树抗寒相关基因提供可能,并为最终分子培育橡胶抗寒品种作分子理论依据上及物质上的积累和储备。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-7
目录  7-10
1 文献综述  10-31
  1.1 植物抗寒研究  10-20
    1.1.1 抗寒机理  10-12
      1.1.1.1 低温引起植物寒害的原因  10-11
      1.1.1.2 生物膜系统  11
      1.1.1.3 低温胁迫下植物的生理生化变化  11-12
    1.1.2 抗寒相关基因  12-18
      1.1.2.1 调控性抗寒相关基因  13-15
      1.1.2.2 功能性抗寒相关基因  15-18
    1.1.3 橡胶树抗寒性研究现状  18-20
      1.1.3.1 橡胶低温胁迫下生理生化变化  19-20
      1.1.3.2 橡胶抗寒相关基因的克隆  20
  1.2 基因差异表达  20-25
    1.2.1 基因差异表达  20-21
    1.2.2 基因差异表达的高通量分析技术  21-25
      1.2.2.1 基因表达序列标签(ExPressedSequeneeTag,EST)  21-22
      1.2.2.2 基因芯片(Gene chip)  22-23
      1.2.2.3 基因表达系列分析(Serial Analysis of Gene Expression,SAGE)  23
      1.2.2.4 mRNA差异显示技术  23-24
      1.2.2.5 消减克隆(subtractive cloning)  24-25
  1.3 基因芯片在植物上的应用  25-29
    1.3.1 寻找特异性相关基因并推测一些已知基因的功能  25-26
    1.3.2 基因差异表达的研究及新基因发现  26-27
    1.3.3 研究与抗逆基因表达调控有关的顺式作用元件和反式作用因子,推测可能的植物抗性机理  27-28
    1.3.4 突变性和多态性检测  28
    1.3.5 功能基因组研究  28-29
    1.3.6 转基因农产品检测和植物检疫  29
  1.4 本研究的目的意义  29-30
  1.5 技术路线  30-31
2 材料与方法  31-38
  2.1 实验材料  31
    2.1.1 cDNA文库  31
    2.1.2 植物材料及处理  31
  2.2 实验方法  31-38
    2.2.1 cDNA阵列的制备  31-32
      2.2.1.1 挑克隆摇菌  31
      2.2.1.2 点膜形成cDNA阵列培养  31
      2.2.1.3 膜上裂解提取DNA  31-32
      2.2.1.4 紫外交联固定  32
    2.2.2 橡胶叶总RNA提取和质量检测  32-33
      2.2.2.1 RNA提取前准备工作  32
      2.2.2.2 橡胶树叶片总RNA的提取方法  32-33
      2.2.2.3 用紫外分光光度法检测RNA纯度和浓度  33
      2.2.2.4 甲醛变性胶电泳检测RNA完整性  33
    2.2.3 探针制备  33-35
      2.2.3.1 RNA反转录  33-34
      2.2.3.2 反转录后cDNA纯化及DIG标记  34
      2.2.3.3 cDNA探针检测  34-35
    2.2.4 杂交洗涤  35-36
      2.2.4.1 预杂交  35
      2.2.4.2 杂交  35-36
      2.2.4.3 洗膜  36
      2.2.4.4 检测  36
    2.2.5 图片扫描及数据获取  36-37
    2.2.6 研究中比较方式  37-38
3 结果与分析  38-46
  3.1 橡胶树叶片总RNA的检测  38
  3.2 探针质量检测  38-39
  3.3 芯片的质量监控  39
  3.4 芯片杂交结果  39
  3.5 不同偏差取值条件和比较方式下差异基因条数  39-40
  3.6 通过cDNA阵列获得橡胶树低温胁迫下基因表达谱  40-43
    3.6.1 低温胁迫和常温条件的基因表达差异分析  40
    3.6.2 抗寒性与不抗寒橡胶品种差异表达分析  40-43
    3.6.3 通过cDNA阵列获得的橡胶树低温胁迫下基因表达谱  43
  3.7 通过cDNA阵列筛选橡胶树低温胁迫下抗寒相关基因  43-46
    3.7.1 温度A、B、C三种比较方式比较结果  43-44
    3.7.2 品种A、B、C三种比较方式比较结果  44-45
    3.7.3 温度和品种A、B、C三种比较方式下差异表达基因  45
    3.7.4 通过cDNA阵列筛选获得的橡胶树低温胁迫下抗寒相关基因  45-46
4 讨论  46-52
  4.1 cDNA阵列的高通量性  46
  4.2 关于总RNA反转录对检测低丰度表达基因的问题  46
  4.3 杂交过程中背景高的问题  46
  4.4 通过cDNA阵列获得的橡胶树低温胁迫下基因表达谱  46-48
  4.5 通过cDNA阵列筛选获得的橡胶树低温胁迫下抗寒相关基因  48-51
    4.5.1 橡胶树低温胁迫下可能的抗寒相关基因  48-51
      4.5.1.1 转录因子基因锌指蛋白、MYB  48-50
      4.5.1.2 蛋白质合成和降解的泛素/26s蛋白酶体途径  50-51
      4.5.1.3 能量代谢相关的过氧化物酶体腺苷酸载体基因、半乳糖-1-磷酸尿苷转移酶  51
    4.5.2 低温诱导、抗寒品种抗寒基因表达的不同  51
  4.6 后续工作  51-52
5 研究总结  52-53
参考文献  53-59
致谢  59

利用cDNA阵列筛选橡胶树抗寒相关基因的研究

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