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华东葡萄病程相关蛋白VpPR10s基因克隆与功能分析

作　者: 邹莹
导　师: 徐炎
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 果树学
关键词: 华东葡萄 病程相关蛋白PR10 核酸酶活性
分类号: S663.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


本试验以中国野生华东葡萄（Vitis pseudoreticulata）株系‘白河-35-1’基因组DNA为模板，根据欧洲葡萄VvPR10基因序列设计引物，采用重叠延伸PCR扩增获得VpPR10.4、VpPR10.6、VpPR10.7、VpPR10.9基因序列，并构建相应的重组原核表达载体，诱导目的蛋白表达与纯化；进一步分析目的纯化蛋白VpPR10.4、VpPR10.6、VpPR10.7、VpPR10.9的核酸酶活性，为华东葡萄病程相关蛋白VpPR10.4、VpPR10.6、VpPR10.7、VpPR10.9抗病机理提供理论依据，取得的主要研究结果如下：1.通过重叠延伸PCR扩增得到VpPR10.4、VpPR10.6、VpPR10.7、VpPR10.9基因序列。氨基酸序列分析表明，VpPR10.4和VpPR10.7氨基酸序列具有PR10家族保守的P-loop和Bet v1结构域；而VpPR10.6氨基酸序列不含有Bet v1保守结构域；VpPR10.9氨基酸序列不含有P-loop和Bet v1保守结构域。VpPR10.4和VpPR10.7氨基酸序列中含有核酸酶活性的特征性氨基酸位点，分别为：E102、E149和Y151；而在VpPR10.9氨基酸序列中，E102被D102取代，在VpPR10.6氨基酸序列中，E149、Y151分别由Q149、H151取代。采用MEGA4.0软件对VpPR10.4、VpPR10.6、VpPR107、VpPR10.9氨基酸序列进行同源性及系统进化关系分析，结果显示：VpPR10.4与VpPR10.6亲缘关系较近，VpPR10.7与VpPR10.9亲缘关系较近。2.构建重组原核表达载体pGEX-4T-1-VpPR10s，转化原核表达菌株E.coli.BL21（DE3），通过优化目的蛋白表达条件，确定pGEX-4T-1-VpPR10.7在28℃、0.1mM IPTG诱导表达4h，可获得大小为43KDa左右的可溶性重组蛋白。收集可溶性蛋白VpPR10.7，用GST纯化树脂纯化目的融合蛋白；对于在不同条件下诱导均以包涵体形式存在的VpPR10.4、VpPR10.6、VpPR10.9蛋白，在28℃、0.1mM IPTG诱导表达4h后，菌体经细菌裂解液裂解，再用包涵体溶解液溶解，随后进行梯度透析，通过真空冷冻干燥，GST纯化树脂纯化得到浓度较高的目的蛋白。3.纯化目的蛋白体外核酸酶活性分析。将8μg的VpPR10.4、VpPR10.6、VpPR10.7、VpPR10.9蛋白分别与中国野生华东葡萄株系‘白河-35-1’叶片总RNA和gDNA进行核酸酶活性试验，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测。结果表明，VpPR10.4、VpPR10.7蛋白具有RNase和DNase活性；而VpPR10.6、VpPR10.9蛋白则无RNase和DNase活性，结果进一步表明VpPR10s蛋白的核酸酶活性与其保守结构域及保守氨基酸位点有关。

全文目录


摘要  6-7
ABSTRACT  7-11
第一章 文献综述  11-15
  1.1 引言  11
  1.2 病程相关蛋白 PR10 研究进展  11-14
    1.2.1 病程相关蛋白及其分类  11-12
    1.2.2 PR10 蛋白的序列及结构特征  12
    1.2.3 PR10 蛋白的组成型表达  12-13
    1.2.4 PR10 蛋白的诱导表达  13
    1.2.5 PR10 蛋白体外核酸酶活性和抑菌作用  13
    1.2.6 PR10 蛋白与病原菌互作  13-14
  1.3 本研究的目的和意义  14-15
第二章 华东葡萄病程相关蛋白基因 VpPR10s 克隆  15-28
  2.1 材料  15-16
    2.1.1 植物材料  15
    2.1.2 载体和菌株  15
    2.1.3 引物  15
    2.1.4 酶及化学试剂  15-16
    2.1.5 主要仪器设备  16
  2.2 方法  16-19
    2.2.1 葡萄叶片基因组 DNA 的提取  16-17
    2.2.2 华东葡萄 VpPR10s 基因全长克隆  17-19
    2.2.3 序列分析  19
  2.3 结果与分析  19-26
    2.3.1 重叠延伸 PCR 扩增 VpPR10s 基因  19-23
    2.3.2 VpPR10s 生物信息学分析  23-26
  2.4 讨论  26-28
第三章 华东葡萄病程相关蛋白基因 VpPR10s 原核表达及重组蛋白纯化  28-41
  3.1 材料  28-29
    3.1.1 引物  28
    3.1.2 载体和菌株  28
    3.1.3 酶及化学试剂  28
    3.1.4 主要仪器设备  28-29
  3.2 方法  29-34
    3.2.1 华东葡萄 VpPR10s 克隆载体构建  29-30
    3.2.2 华东葡萄 VpPR10s 基因原核表达载体的构建  30-31
    3.2.3 华东葡萄 VpPR10s 蛋白的融合表达及纯化  31-34
  3.3 结果与分析  34-40
    3.3.1 华东葡萄 VpPR10s 基因表达载体的构建  34-36
    3.3.2 华东葡萄 VpPR10s 蛋白的诱导表达及可溶性分析  36
    3.3.3 华东葡萄 VpPR10s 融合蛋白的纯化  36-40
  3.4 讨论  40-41
第四章 华东葡萄病程相关蛋白 VpPR10s 核酸酶活性分析  41-46
  4.1 材料  41
    4.1.1 植物材料  41
    4.1.2 酶及化学试剂  41
    4.1.3 主要仪器设备  41
  4.2 方法  41
    4.2.1 华东葡萄病程相关蛋白 VpPR10s 核糖核酸酶活性分析  41
    4.2.2 华东葡萄病程相关蛋白 VpPR10s 脱氧核糖核酸酶活性分析  41
  4.3 结果与分析  41-44
    4.3.1 华东葡萄病程相关蛋白 VpPR10s 降解葡萄总 RNA 活性分析  41-44
    4.3.2 华东葡萄病程相关蛋白 VpPR10s 降解葡萄基因组 DNA 活性分析  44
  4.4 讨论  44-46
第五章 结论  46-47
参考文献  47-51
缩略词  51-52
致谢  52-53
作者简介  53

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中图分类: > 农业科学 > 园艺 > 果树园艺 > 浆果类 > 葡萄
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