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大豆NBS类抗病基因同源片段的克隆及遗传转化的初步研究

作　者: 石松青
导　师: 潘大仁
学　校: 福建农林大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 大豆 NBS类抗病基因同源片段 遗传转化
分类号: S565.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
下　载: 23次
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内容摘要


大豆不仅是重要的高蛋白饲料与油料作物，在我国更是一种传统的美食，其丰富多样的豆类食品深受人们的喜爱，成为大众生活中必不可缺的重要食物。历来多种病虫害严重地影响了大豆的品质与产量，加之外来转基因大豆大量入侵使得我国本土大豆工业面临了巨大的挑战。NBS类抗病基因在植物抗病基因组中含量较多而且具有保守的结构域，为其从大豆中克隆出这类抗病基因提供了可能，从抗病性强、蛋白高的地方大豆中克隆出抗病基因转入其他基因型品种对于研究NBS结构域的功能及抗病机理、抗病基因的连锁定位、大豆抗病育种有重要的意义。研究结果如下：1. NBS类抗病基因同源片段的克隆：根据抗病基因保守结构域设计3对简并引物通过RT-PCR，从湖南黑豆与福建黑豆的cDNA中扩增出100多个克隆，测序鉴定出2个有通读阅读框并且具有NBS结构域的片段：FNBS1、FNBS3。FNBS1大小为534bp，编码181个氨基酸，包含P—loop、kinase--2、HD等结构域；FNBS3大小为513bp，编码169个氨基酸，包含P—loop、HD等结构域，2个片段均具有NB-ARC结构域（在植物中与抗病有关），FNBS1与大豆抗病蛋白RPM1同源性为97%，FNBS3与大豆抗TMV蛋白的同源性为99%。2.农杆菌介导大豆转化体系的优化：本实验研究了不同基因型、不同的器官、抗氧化剂等因素对遗传转化的影响，对大豆的转化体系进行了优化。通过对3个不同基因型的丛芽发生能力的比较发现湖南青豆的丛芽率最高达到60%，平均丛芽发生能力大于3；对比福建青豆不同的器官发现子叶节的丛芽率最高达到35%；在研究抗氧化剂对转化效率影响的实验中发现，添加适量的抗氧化剂能明显提高GUS瞬间表达率，从15.2%显著提高到40.8%，而且能有效地抑制浸染过程外植体伤口处的褐化与组织的死亡。3.大豆NBS类抗病基因同源片段的遗传转化：构建了植物表达载体pFGC5941-NBS，通过农杆菌介导转化大豆与烟草，得到了大豆转基因阳性苗2株，转化率为1.08%，得到烟草转基因阳性苗15株，转化率达到45.6%,经除草剂涂抹烟草实验发现阳性植株的抗除草剂能力明显高于未转基因的植株。

全文目录


摘要  7-8
Abstract  8-10
1 文献综述  10-24
  1.1 引言  10-11
  1.2 野生大豆的研究进展  11-12
  1.3 抗病基因（R）综述  12-17
    1.3.1 大豆 NBS-LRR 类抗病基因同源克隆研究  14-16
    1.3.2 R 基因克隆的方法  16-17
  1.4 大豆遗传转化的研究  17-22
    1.4.1 大豆遗传转化的方法  18-20
    1.4.2 大豆遗传转化的再生体系  20-22
  1.5 影响农杆菌介导大豆遗传转化的因素  22-23
    1.5.1 大豆品种及受体材料  22
    1.5.2 农杆菌的株型  22-23
    1.5.3 酚类化合物与抗氧化剂  23
  1.6 目的与意义  23-24
2 材料与方法  24-32
  2.1 材料  24
    2.1.1 大豆品种  24
    2.1.2 菌株及质粒  24
    2.1.3 药品与试剂盒  24
    2.1.4 主要的仪器设备  24
  2.2 实验方法  24-32
    2.2.1 NBS 类抗病基因同源片段的克隆  24-26
    2.2.2 NBS 类抗病基因真核表达载体的构建  26-29
    2.2.3 农杆菌介导大豆子叶节遗传转化及优化体系的研究  29-32
    2.2.4 叶盘法转化烟草  32
3 结果与分析  32-56
  3.1 大豆 NBS 类抗病基因同源片段的克隆及分析鉴定  32-41
    3.1.1 大豆叶片基因组 DNA 的提取及 PCR 扩增  32-33
    3.1.2 RNA 的提取及 RT-PCR  33-34
    3.1.3 目的基因片段的测序及分析鉴定  34-41
  3.2 真核表达载体的构建  41-42
  3.3 农杆菌介导大豆转化体系的优化  42-51
    3.3.1 消毒时间对大豆种子发芽与污染的影响  42-43
    3.3.2 不同器官外植体对丛芽的影响  43-46
    3.3.3 不同基因型子叶节外植体对丛芽的影响  46-48
    3.3.4 抗氧化剂对农杆菌介导大豆子叶节 GUS 瞬间表达的影响  48-50
    3.3.5 转基因大豆的再生过程  50-51
  3.4 转基因大豆阳性植株的检测  51-52
    3.4.1 PCR 检测  51-52
  3.5 转基因烟草的再生  52-53
  3.6 转基因烟草的 PCR 检测  53-54
  3.7 除草剂涂抹检测  54-56
4 讨论  56-59
  4.1 大豆中 NBS 类抗病基因同源片段的克隆与鉴定  56-57
  4.2 大豆抗病基因 NBS 同源序列表达检测  57
  4.3 大豆遗传转化体系的优化  57
  4.4 后续工作  57-59
5 结论  59-61
参考文献  61-69
附录Ⅰ pFGC5941 载体图谱  69-70
附录Ⅱ 培养基及部分试剂配方  70-71
致谢  71

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 经济作物 > 油料作物 > 大豆
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