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AtNTL5过表达高羊茅耐盐性分析及大豆耐盐相关基因GmDREB1D及GmRF功能的初步分析

作　者: 曹凌雪
导　师: 向凤宁
学　校: 山东大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 盐胁迫 高羊茅 大豆 DREB RING-finger 拟南芥
分类号: S688.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
下　载: 69次
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内容摘要


土壤盐渍化对全球的农业生产具有极大的负面影响,严重降低了农作物的产量。植物能够通过一系列生化和生理调节来适应和改造盐碱土壤环境,因此利用植物的这种特性,以及一些优良的耐盐碱植物种质资源培育耐盐作物品种对于改良和利用盐碱地具有极为重要的社会和经济意义。利用基因工程在增强植物的耐盐性方面已经取得了一些相关的研究进展,已经识别及克隆了大量的盐胁迫相关基因,并将这些基因转入植物中,用于盐碱土地的农业利用和修复研究。很多实验表明,将盐胁迫相关基因转入某些农作物,这些盐胁迫相关基因的异源表达能够提高植物对盐胁迫的耐受能力。本实验建立了生物量高、生长快的优质草坪草高羊茅的愈伤组织转化体系,并将本实验室通过前期实验获得及验证的一个拟南芥盐胁迫相关基因AtNTL5通过农杆菌介导的愈伤组织转化方法转入高羊茅中,最终筛选获得了29株表达AtNTL5的高羊茅转基因植株,转化率达到9.7%。同时,对获得的AtNTL5高羊茅转基因植株进行了分子生物学和耐盐性初步鉴定,为进一步研究转基因草坪草的耐盐分子机制以及盐渍化土壤的草坪草大规模种植奠定了基础。另一方面,本实验从本实验室筛选的大豆抗旱/耐盐品种---圣豆9号中筛选了两个上调表达的盐胁迫相关基因GmDREB1D和GmRF,并对其基因功能进行了初步分析。GmDREB1D基因编码一个由231个氨基酸残基构成的蛋白,该蛋白具有一个由60个氨基酸残基构成的AP2/EREBP保守结构域。酵母转录激活活性实验证明GmDREB1D转录因子具有转录激活活性。大豆植株半定量RT-PCR实验发现GmDREB1D在大豆植株的各个组织内均有表达,其中,茎和叶片中的表达量较高,推测该基因可能与大豆的地上营养器官的发育与生长相关。半定量RT-PCR分析还发现GmDREB1D对ABA、盐和冷胁迫都有一定的响应,因此我们推测该基因可能广泛参与上述激素及非生物胁迫信号传导和调控过程。GmDREB1D过表达转基因拟南芥的成熟植株矮小,生长缓慢,叶片浓绿,抽薹时间晚甚至终生不抽薹开花,表现出生长缓滞的特征,并且表型的强烈程度与GmDREB1D基因的表达水平间存在正比关系。胁迫处理实验发现GmDREB1D在转基因拟南芥中的表达提高了植株对盐和冷胁迫的耐受力。GmRF编码具有一个由47个氨基酸残基构成的C4HC3锌指蛋白结构域的RING-finger转录因子,该转录因子在C端还有两个跨膜结构域。作为转录因子GmRF应该具有转录激活的活性,通过酵母转录激活活性试验验证了该结论。对大豆植株的不同组织进行半定量RT-PCR分析发现,GmRF在各个组织中均有表达,并且表达量基本一致,不具有明显的组织特异性。对ABA、盐和干旱等激素及非生物胁迫的基本应答模式的半定量RT-PCR的结果显示GmRF对ABA、盐胁迫和干旱有一定的响应。GmRF基因的表达能够在一定程度上增强拟南芥植株的对盐和干旱的胁迫耐受能力。

全文目录


中文摘要  9-11
Abstract  11-13
缩略词  13-14
第一章 文献综述  14-29
  1.植物耐盐研究现状  14-18
    1.1 盐胁迫对植物的影响  14-15
    1.2 植物耐盐相关基因研究  15-17
      1.2.1 渗透调节相关基因  15-16
      1.2.2 植物耐盐保护性蛋白相关基因  16-17
    1.3 植物耐盐基因工程研究进展  17-18
  2.草坪草性状改良研究进展  18-20
    2.1 草坪草简介  18-19
    2.2 草坪草遗传转化方法及改良  19-20
  3.大豆耐盐基因工程研究  20-22
    3.1 盐对大豆的影响  20-21
    3.2 大豆耐盐基因工程研究进展  21-22
  4.AP2/EREBP转录因子  22-26
    4.1 AP2/EREBP转录因子基因家族  22-23
    4.2 CBF/DREB转录因子的结构特点  23
    4.3 DREB转录因子在非生物胁迫中的作用  23-26
    4.4 DREB基因增强植物抗逆性相关研究  26
  5.植物锌指蛋白研究进展  26-29
    5.1 RING finger蛋白的发现、结构特点及分类  27-28
    5.2 植物RING finger的功能研究进展  28-29
  6.立题意义  29
第二章 耐盐基因ATNTL5的高羊茅遗传转化  29-44
  1.实验材料  29-31
    1.1 植物材料  29-30
    1.2 菌株  30
    1.3 质粒  30
    1.4 常用试剂及培养基  30-31
      1.4.1 试剂  30
      1.4.2 常用培养基  30-31
  2.实验方法  31-38
    2.1 农杆菌介导的高羊茅转化  31-32
      2.1.1 高羊茅愈伤组织诱导  31
      2.1.2 农杆菌的准备  31
      2.1.3 转化  31-32
    2.2 植物基因组DNA提取(CTAB法)  32
    2.3 PCR检测转基因植株  32-33
    2.4 Southern-blot分析  33-37
    2.5 总蛋白SDS-PAGE分析  37-38
    2.6 转基因高羊茅植株耐盐性分析  38
  3.实验结果  38-43
    3.1 高羊茅愈伤组织诱导及再生体系的建立  38
    3.2 AtNTL5基因对高羊茅愈伤组织的转化  38
    3.3 高养茅愈伤组织诱导及转基因植株的生长情况  38-39
    3.4 转基因植株的检测  39-41
    3.5 SDS-PAGE分析转基因高羊茅植株总蛋白  41-42
    3.6 转AtNTL5高羊茅抗盐性初步分析  42-43
  4.讨论  43-44
第三章 大豆AP2/EREBP家族基因GMDREB1D基因克隆及功能初步分析  44-72
  1.实验材料  44-47
    1.1 植物材料  44
    1.2 植物培养材料  44
    1.3 菌株和载体  44
    1.4 生化试剂和酶  44-45
    1.5 实验仪器  45
    1.6 溶液和培养基的配制  45-47
      1.6.1 常用溶液  45-46
      1.6.2 常用培养基  46-47
  2.实验方法  47-58
    2.1 植物总RNA提取  47-48
    2.2 cDNA合成  48
    2.3 植物DNA提取(CTAB法)  48
    2.4 PCR扩增  48-50
      2.4.1 普通TAQ酶催化的RT-PCR扩增(20 ML克隆体系)  48-49
      2.4.2 高保真酶PRIMER STAR基因克隆反应体系(50μL克隆体系)  49-50
    2.5 克隆得到基因片段的纯化回收(天根试剂盒)  50
    2.6 克隆基因片段的连接或BP、LR反应  50-51
      2.6.1 连接(Takara T4 DNA连接酶)  50-51
      2.6.2 BP和LR反应(Gateway系统)  51
    2.7 大肠杆菌感受态的制备和质粒转化  51
      2.7.1 感受态的制备(无菌操作)  51
      2.7.2 大肠杆菌的转化  51
    2.8 大肠杆菌质粒提取  51-53
      2.8.1 碱裂解法提取大肠杆菌质粒  51-52
      2.8.2 试剂盒提取大肠杆菌质粒(天根试剂盒)  52-53
    2.9 基因转录激活活性分析  53-55
      2.9.1 载体构建  53-54
        2.9.1.1 目的基因的获得  53
        2.9.1.2 载体构建步骤  53-54
      2.9.2 酵母感受态制备  54
      2.9.3 酵母质粒转化  54
      2.9.4 阳性酵母菌株的鉴定及保存  54-55
      2.9.5 -His缺陷培养基筛选及β-半乳糖苷酶显色反应  55
    2.10 农杆菌感受态的制备和质粒转化  55-56
      2.10.1 感受态制备  55-56
      2.10.2 农杆菌质粒转化  56
    2.11 花侵染法转化拟南芥  56
    2.12 拟南芥种了表面灭菌  56
    2.13 拟南芥转基因植株筛选  56-57
    2.14 非生物胁迫和激素处理大豆  57
    2.15 转基因拟南芥逆境处理下的表型  57-58
      2.15.1 转基因拟南芥植株对高盐的耐受性  57
      2.15.2 转基因拟南芥植株对干旱的耐受性  57-58
      2.15.3 转基因拟南芥植株对冷的耐受性  58
    2.16 转基因拟南芥萌发率测定  58
    2.17 转基因拟南芥逆境处理下的根的生长  58
  3.结果与讨论  58-70
    3.1 候选基因GmDREB1D的筛选及克隆  58-59
    3.2 序列及系统进化分析  59-61
    3.3 GmDREB1D转录激活活性分析  61-63
    3.4 GmDREB1D基因组织表达模式及其对激素和非生物胁迫的应答模式分析  63-64
    3.5 p35S::GmDREB1D载体构建  64-65
    3.6 拟南芥转化及过表达转基因纯系的获得  65-66
    3.7 35S::GmDREB1植株表型  66-67
    3.8 355::GmDREB1植株根在非生物胁迫下的生长情况  67-68
    3.9 高盐和低温胁迫下的35S::GmDREB1植株表型分析  68-70
  4.讨论  70-72
第四章 大豆锌指蛋白家族转录因子GMRF基因克隆及功能初步分析  72-84
  1.实验材料  72
  2.实验方法  72
  3.结果与讨论  72-82
    3.1 候选基因GmRF的筛选及克隆  72-73
    3.2 GmRF氨基酸序列及系统分析  73-74
    3.3 GmRF转录激活活性分析  74-75
    3.4 基因组织表达模式及对激素和非生物胁迫的应答模式分析  75-76
    3.5 拟南芥过表达转基因植株的获得  76-78
    3.6 p35S::GmRF过表达拟南芥表型分析  78-80
    3.7 非生物胁迫下的GmRF转基因拟南芥根生长  80-82
  讨论  82-84
参考文献  84-94
附录 引物列表  94-95
致谢  95-96
学位论文评阅及答辩情况表  96

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中图分类: > 农业科学 > 园艺 > 观赏园艺（花卉和观赏树木） > 园林植物栽培及应用技术 > 草坪与地被植物
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