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用胡杨油菜素内酯合成酶基因PeCPD转化马铃薯的研究

作　者: 张炳
导　师: 王新宇
学　校: 兰州大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 马铃薯 遗传转化 油菜素内酯 PeCPD 胡杨
分类号: S532
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


马铃薯(Solarium tubemsum L.)是一种干旱和半干旱地区广泛栽培种植的重要蔬菜兼粮食作物之一。但是种质退化、病毒侵染、自然条件恶化、栽培技术落后等因素严重制约着其产量和品质。油菜素类固醇(Brassinosteroids, BRs)是上世纪七十年代初期新发现的一类植物生长调节物质,在调节植物细胞伸长,育性,色素合成,开花时期、种子萌发、抗逆性、光形态建成等方面发挥重要作用。CPD (constitutive photomorphogenesis and dwarfism)基因编码一种甾醇类23a羟化酶,在BR生物合成中起重要作用。最近,本实验室从极端抗逆的胡杨中克隆了与拟南芥CPD同源的cDNA命名为PeCPD.为了探索通过改变内源BR水平,改良马铃薯种质的可能性,本研究利用与绿色荧光蛋白基因(GFP)融合的PeCPD基因(PeCPD-GFP)对‘甘农薯2号’试管薯进行转化研究,主要获得了以下结果：1.建立了一个较高效的试管薯转化体系。本研究将直径为0.8～1.0cm试管薯切成1～2mm的薄片,在OD600=0.35的农杆菌侵染液中侵染10min,在添加0.002%AS的共培养基中暗培养2天,然后转入添加0.5mg/L赤霉素、10mg/L潮霉素的分化培养基中诱导分化。在此条件下,潮霉素抗性苗平均得率为12.5%。分别以GFP和PeCPD的特异引物,对22株抗性苗中的10株进行PCR鉴定,发现其中5个株系(P1、P3、P7、P8和P9)为阳性,阳性率为50%。2.利用RT-PCR技术,对上述5个PCR阳性株系PeCPD基因的转录水平进行了检测,发现PeCPD在P1、P3、P7、P9四个株系中有不同程度表达,在野生型中不表达。3.荧光显微镜检测发现,P3和P9系根尖显示较强的GFP荧光；共聚焦荧光显微镜观察发现,GFP在根冠和分生区细胞质中表达最强,在细胞核和细胞壁中没有表达。4.测定以上转基因系试管苗对NaCl胁迫的耐受力发现,转基因试管苗的存活率和根部生物量均明显地高于野生型,表明转基因试管苗对盐胁迫的耐受力有所增强。5.将各转基因系试管苗移栽到温室土壤中,与对应的野生型相比,(a)节间数目增多,茎的直径和株高增加；(b)叶柄变扁；(c)叶片加厚,栅栏组织细胞宽度增加,长度减小;(d)叶片气孔密度和开度明显增加；(e)叶片总叶绿素和类胡萝卜素含量明显提高,其中叶绿素b含量增加幅度最大。6.经过诱导,以上转基因系试管苗产生了试管薯。与野生型试管薯相比,(a)平均单薯重量和单株薯产量显著提高；(b)平均单株结薯数目明显减少；(c)畸形薯比例明显增加；(d)淀粉粒增大,小型淀粉粒比例降低,淀粉含量明显增高。7.将以上转基因试管薯栽培于室外花盆内土壤,由此产生的实生苗与野生型实生苗相比,P1、P7、P9系(a)叶柄长度明显增加；(b)叶片气孔密度明显提高；(c)叶总叶绿素和类胡萝卜素含量明显提高,叶绿素b增加幅度也最大；(d)净光合速率、蒸腾速率和气孔导度均明显高于野生型；(e)收获的转基因实生薯与野生型相比单株产量高、单薯重,薯形大,结薯数目多。P3系变化不大。综上所述,胡杨PePCD基因的异源表达对马铃薯表型、生理生化特性、光合作用以及产量和质量都有明显的影响。这种现象不仅有利于研究PeCPD基因的功能,而且为选育品质和产量优良的马铃薯新品种提供了工作基础,具有较高的科研价值和应用价值。

全文目录


英文縮略词表  3-4
中文摘要  4-6
Abstract  6-11
第一章 前言  11-19
  一、油菜素类固醇在植物中的生理作用  11-13
    1. 油菜素类固醇的发现  11
    2. BR和其他激素之间的相互作用  11-12
    3. BR促进植物生长的机制  12-13
  二、油菜素类固醇生物合成的研究  13-15
    1. BR生物合成相关突变体和基因  13-15
    2. BR生物合成基因的负向反馈调控  15
  三、油菜素类固醇在农业中的应用  15-17
    1. 农作物中BR合成相关突变体  15-16
    2. BR在农作物中的应用策略  16-17
  四、CPD基因的研究进展  17-18
  五、研究目的和意义  18-19
第二章 根癌农杆菌介导PeCPD-GFP基因转化马铃薯体系的建立  19-31
  一、材料方法  19-21
    1. 植物材料  19
    2. 菌株和质粒  19
    3. 试管苗潮霉素耐性测定  19-20
    4. 转化体系的建立和优化  20
    5. 抗性苗快速繁殖与诱导生根  20
    6. 转PeCPD-GFP基因植株分子检测  20-21
    7. 转PeCPD-GFP基因植株荧光检测  21
  二、结果分析  21-28
  三、讨论  28-31
    1. 试管薯的转化  28-29
    2. 转录水平基因的沉默  29-30
    3. GFP荧光蛋白的表达  30-31
第三章 转PeCPD-GFP基因对试管苗和移栽苗表型和生理的影响  31-43
  一、材料方法  31-32
    1. 植物材料  31
    2. 转基因试管苗表型分析  31
    3. 转基因试管苗耐盐性  31
    4. 转基因移栽苗表型和GFP荧光观察  31-32
    5. 转基因移栽苗气孔特性分析  32
    6. 转基因移栽苗叶片叶绿素含量测定  32
    7. 转基因移栽苗叶的解剖观察  32
  二、结果分析  32-41
  三、讨论  41-43
    1. 转基因试管苗和移栽苗表型分析  41
    2. NaCl胁迫  41-42
    3. 转基因植株气孔特性分析  42
    4. 转基因植株叶片叶绿素含量分析  42
    5. 转基因植株叶解剖结构的影响  42-43
第四章 转PeCPD-GFP基因对试管薯和实生苗表型和生理的影响  43-57
  一、材料方法  43-44
    1. 植物材料  43
    2. 转基因试管薯表型分析  43
    3. 转基因试管薯淀粉粒和淀粉含量分析  43
    4. 转基因试管薯维生素C含量测定  43
    5. 转基因实生苗表型分析  43-44
    6. 转基因实生苗叶片气孔特性分析  44
    7. 转基因实生苗叶片叶绿素含量分析  44
    8. 转基因叶片实生苗光合参数测定  44
    9. 转基因叶片实生薯的收获  44
  二、结果分析  44-54
  三、讨论  54-57
    1. 转基因试管薯的农艺性状  54-55
    2. 淀粉粒形状和染色以及淀粉含量  55
    3. 转基因试管薯维生素C含量  55
    4. 转基因实生苗表型  55-56
    5. 转基因实生苗气孔表型  56
    6. 转基因实生苗叶绿素和光合参数  56-57
参考文献  57-66
就读期间主要研究成果  66-67
致谢  67

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 薯类作物 > 马铃薯（土豆）
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