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高粱耐盐碱种质资源筛选及木质素合成相关基因鉴定
作 者: 闫丽
导 师: 夏光敏
学 校: 山东大学
专 业: 细胞生物学
关键词: 高粱 抗盐碱种质 bmr 差异表达基因 木质素
分类号: S514
类 型: 博士论文
年 份: 2011年
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内容摘要
由于石油、天然气和煤炭等不可再生能源的常年开采而逐渐面临资源枯竭,全球正遭遇着越来越严重的能源危机。我国地域广阔、人口众多,资源丰富,但人均资源则相对匮乏,随着我国经济的高速发展,对能源需求量巨大,能源危机更为突出。因此,探索可再生、可持续、无污染、高效清洁的新能源已成为我国乃至全球科学家重点研究的目标之一。生物乙醇作为唯一一种能以液态形式存在的新能源,是我国现阶段最有可能实现产业化生产的主要生物能源产品之一,也是我国生物能源产业发展的重点。以粮食和油料作物为原料来生产乙醇可能会威胁国家粮油食品安全,而植物纤维素则是一种非常有潜力、前景广阔的生物乙醇的生产原料。我国有大量的盐碱地、荒地、次生退化土壤,因此结合我国国情,充分利用好这些宜耕边际性土地,筛选、培育适应性好、抗逆性强、具有较高生物量的能源作物高粱等,为生物乙醇生产提供大量优质原料具有重要意义。高梁具有C4植物的高光合效率,抗逆性强,生长期短,适应性广。即使在贫瘠、盐碱、干旱土地上种植也有较高产量和生物量。此外高粱基因组较小,有丰富的种质资源和生物信息学资源,又有大量EMS诱发的突变体,因此有必要选择出其中的耐盐碱种类进行深入研究、分析,培育出能在盐碱地、旱地正常生长发育的能源高粱新品系,对大量黄/褐中脉突变体的研究,有利于从分子机理上了解木质素代谢的调控,为进一步通过基因工程改良能源高粱创造条件。植物通过光合作用将绝大部分有机物转化为细胞壁成分,其主要成分为纤维素、半纤维素、木质素。木质素的水解产物影响纤维素酶对纤维素的水解效率,使纤维素转化为乙醇的成本提高。因此有必要系统认识高粱木质素合成及其基因表达调控的分子机制,分离木质素合成调控的关键基因。多种作物黄/褐色中脉(bmr)突变体的木质素含量明显降低,是研究木质素合成及调控的良好试验材料。但是至今为止,仅对少数bmr突变体与木质素合成的关系有所了解,大多数的突变体还有待于进一步研究。为了寻找耐盐碱的高粱品种,本论文对美国农业部收集的高梁种质资源进行筛选,获得抗盐碱种质材料,为在盐碱地发展能源植物提供了有用的实验材料;本论文同时通过抑制性差减(SSH)技术分别构建13种bmr突变体混合体与BTx623野生型对照的正、反向差减文库;从正反向文库中挑选cDNA片段制作基因芯片,分析其表达模式;根据基因的表达模式,从中筛选与木质素合成及调控相关的EST片段,并进一步克隆了部分差异表达基因;初步鉴定了这些基因的功能,为高粱及其它能源植物细胞壁成分的改良,培育低木质素的新种类提供了有益的线索。具体研究内容及结果包括:1.高粱耐盐性种质资源筛选根据美国农业部植物研究服务署(USDA-ARS)种植资源系统(National Plant Germplasm System)所收集管理的高粱信息,我们在其收集的1200多份甜高粱中选取锤度大于10,蔗糖含量高于4的甜高粱717份,及四万多份粒用高粱中高度大于2,5米,整齐度小于2.5的粒用高粱4222份,重新编号,进行大规模、高强度(150-200mmol/L NaCl)、长时间(25-40天)的耐盐性筛选。通过对甜高粱的两轮耐盐性筛选,共得到了耐盐株系83个,移栽成活65个株系,其中46个株系收到种子;对普通高粱进行耐盐碱筛选,并移种大田或花盆312个株系,大多数完成生活周期并获得了种子。在东营盐碱地中播种了31种筛选得到的耐盐甜高粱,结果表明碱地中甜高粱的出苗率略高于盐碱地。但其总生物量差异不大,盐碱地单株平均重量比碱地高。多数甜高粱在盐碱地中的锤度高于碱地。不同甜高粱的单株种子产量在盐碱地和碱地差异很大。盐碱地生长的甜高粱比同时播种在碱地的甜高粱提早成熟5-7天。2.利用SSH和cDNA芯片技术分析bmr突变体和野生型高粱BTx623的表达差异为了研究高粱bmr突变体细胞壁合成代谢及调控机制,我们用抑制性差减(SSH)文库和cDNA芯片联用的方式检验了bmr突变体和野生型高粱BTx623的差异表达基因。共得到153个差异表达基因,其中43个在bmr突变体中上调表达,110个基因在bmr突变体中表达受抑制。我们对其中12个差异表达基因进行半定量RT-PCR验证,结果证明了基因芯片数据是正确的。差异表达基因根据功能不同可分为11类:代谢、光合作用、遗传信息的加工、胁迫响应、蛋白命运、信号转导、转运、木质素合成、细胞过程和移动性、发育和调节及其它,其中代谢类的差异表达基因数量最多。光合作用类别的17个差异表达基因中,16个在bmr突变体中的表达都受到抑制,这一点和部分bmr突变体生物量减少的表型相一致。结果,我们从高粱bmr突变体中找到了一批差异表达基因,其中的CYP基因在bmr突变体中表达下调,这与bmr突变体中木质素含量降低一致;而木质素合成的苯基丙烷途径中的一个C4H基因,在bmr突变体中表达上调,该结果可能预示高粱的三个C4H在合成细胞壁的过程中,其功能有所分化;MYB.NAC.Lim等转录因子的表达在bmr突变体和野生型中没有明显的差异,但却发现bHLH转录因子在多个bmr突变体中明显上调表达。本文进一步对这3个基因进行了结构、表达分析及功能的初步鉴定。3.高粱木质素合成代谢相关基因的功能鉴定SbHLH的功能研究SbHLH是13种bmr突变株系与野生型SSH筛选和芯片杂交后得到的表达上调最高的一个转录因子,该基因信号在芯片杂交结果中重复出现达6次之多,表明其可能是多种bmr变体共有的一个调节信号。RT-PCR结果表明,7个bmr变体的叶片在7叶期该基因的表达也明显上调。SbHLh在根、茎、叶中有不同的转录活性,在叶中表达量最高,茎中的表达量最低,这与该器官的木质化程度有密切关系。在酵母菌中,全长SbHLH具有转录激活活性,表明它是一个转录因子;缺失N端低复杂性区时,即使HLH结构域完整存在也没有转录活性,说明该低复杂性区对HLH结构域及转录激活功能的重要性;C端缺失不能影响其转录激活能力。通过该蛋白偶联GFP,基因枪法转化洋葱表皮,结果表明该基因表达产物定位在细胞核。在拟南芥中过表达SbHLH后,转基因拟南芥的表型在幼苗期没有明显变化,也能正常完成的生长周期,但在后期由于茎伸长,过表达系比野生型容易发生倒伏。6周龄的冰冻切片染色结果及木质素含量测定表明,过表达拟南芥茎的木质素含量比野生型和空载体对照明显降低,木质素合成途径和类黄酮/花青素合成途径中部分相关基因的表达受到不同程度的抑制,如]DAL1,4CL,CCR1, HCT, COMT, CHI, UGT等基因。因此,SbHLH很可能是苯基丙烷代谢途径的转录抑制因子。SbCYP功能研究SbCYP基因在多个bmr突变体的7叶期中均呈现下调表达的趋势;与之相反,该基因在野生型高粱(BTx623)的5叶期到7叶期的表达呈上调趋势。在拟南芥中过表达SbCYP后,转基因拟南芥能完成正常的生长发育周期但在6周龄时的茎中,木质素含量和野生型拟南芥没有明显差异,不过在8周龄过表达的拟南芥株系茎中,木质素含量则明显升高;同时部分木质素合成相关基因(PAL1,4CL1, CCoAOMT, CCR1等基因)也被诱导表达,这些结果说明SbCYP参与了木质素的合成或调控。SbCYP的调控模式在bmr突变体与野生型高粱中明显不同,这可能是造成bmr突变体木质素含量降低的原因之一,也可能是受到其它上游基因(例如SbHLH)调控后出现的效应。SbC4H功能研究SbC4H基因在多个bmr突变体中都呈现出上调表达的趋势。将SbC4H生拟南芥中过表达后,在6周龄的转基因拟南芥,其茎中的木质素的含量较野生型明显降低,同时SbC4H过表达拟南芥中的部分木质素合成相关基因(例如4CL1,4CL, F5H1)的表达受到一定的抑制。总之,通过对高粱bmr突变体和野生型高粱中的差异表达基因SbHLH, SbCYP和SbC4H在木质素合成中的功能研究,发现他们在木质素合成及调控中起着重要作用,实验结果丰富了我们对bmr突变体以及木质素合成调控的认识,也为进一步的能源作物的细胞壁改良提供了理论基础和候选基因。
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全文目录
摘要 7-11 Abstract 11-15 符号说明 15-16 第一章 文献综述 16-37 一、全球能源危机 16 二、国际生物能源发展现状 16-18 三、能源作物高粱 18 四、植物细胞壁与纤维素降解 18-19 五、木质素的合成与调控 19-27 六、细胞壁合成突变体 27-32 七、SSH文库与基因芯片技术 32-35 八、立题依据与研究内容 35-37 第二章 美国农业部高粱资源耐盐碱种质筛选 37-56 一、材料及方法 38-40 1.实验材料 38 2.实验方法 38-40 二、实验结果 40-46 1.BTx623的耐盐性 40 2.甜高粱耐盐种质的筛选 40-42 3.耐盐甜高粱在山东东营滨海盐碱地的生长状况 42-45 4.普通粒用高粱耐盐种质资源的筛选 45-46 三、讨论 46-56 第三章 利用SSH和基因芯片技术分析高粱bmr突变体的差异表达基因 56-88 一、实验材料与方法 56-69 1.植物材料 56 2.菌株 56 3.主要溶液和培养基 56-57 4.实验方法 57-69 4.1 RNA的提取和纯化 57-58 4.2 SSH cDNA文库构建 58-64 4.3 文库芯片的制作及杂交 64-68 4.4 芯片的信号扫描及信号处理 68 4.5 芯片数据分析 68-69 4.6 半定量RT-PCR 69 二、实验结果 69-87 1.bmr突变体的表型 69-70 2.RNA的检测 70-71 3.酶切结果检测 71 4.抑制性差减杂交 71 5.差减效率的检测 71-72 6.阳性克隆的筛选 72 7.芯片的制备与杂交 72-73 8.芯片结果数据处理 73 9.RT-PCR验证 73-74 10.芯片杂交结果分析 74-87 10.1 芯片结果的GO注释及分类 74-77 10.2 芯片结果功能分类 77-87 三、讨论 87-88 第四章 木质素合成相关基因的研究 88-136 一、实验材料与方法 89-107 1.植物材料与生长条件 89-90 2.菌株和质粒 90 3.主要溶液和培养基 90-93 3.1 主要溶液 90-92 3.2 主要培养基 92-93 4.实验方法 93-107 4.1 目的基因cDNA克隆及序列分析 93-98 4.2 基因的表达模式分析 98 4.3 基因亚细胞定位 98-102 4.4 基因体外转录活性分析 102-103 4.5 拟南芥过表达转基因系的获得 103-106 4.6 过表达转基因拟南芥表型分析 106-107 4.7 过表达植株中相关的Marker基因的表达模式研究 107 二、结果与分析 107-130 (一) SbHLH转录因子的功能鉴定 107-117 1.1 SbHLH在SSH和芯片中的表达变化情况 107-108 1.2 SbHLH cDNA的克隆 108-110 1.3 SbHLH在高粱中的表达情况 110-111 1.4 SbHLH的亚细胞定位 111 1.5 SbHLH体外转录活性分析 111-112 1.6 拟南芥SbHLH过表达转基因植株的获得 112-113 1.7 利用拟南芥过表达技术研究SbHLH基因的功能 113-117 1.8 小结 117 (二) SbCYP78在木质素合成中的功能研究 117-125 2.1 SbCYP78在芯片中的表达变化情况 117 2.2 SbCYP cDNA的克隆 117-119 2.3 SbCYP在高粱中的表达情况 119-120 2.4 SbCYP在几个bmr突变体中的cDNA序列 120-121 2.5 拟南芥SbCYP过表达转基因植株的获得 121-122 2.6 利用拟南芥转基因过表达株系研究SbCYP的功能 122-124 2.7 小结 124-125 (三) SbC4H在木质素合成中功能研究 125-130 3.1 SbC4H在高粱中的表达情况 125 3.2 SbC4H基因的克隆 125-127 3.3 SbC4H的亚细胞定位 127 3.4 拟南芥SbC4H过表达转基因植株的获得 127-129 3.5 SbC4H过表达拟南芥茎中木质素含量变化 129 3.6 拟南芥转基因植株Marker基因的表达变化 129-130 3.7 小结 130 四、讨论 130-136 总结 136-138 附录 138-140 参考文献 140-155 博士研究生在读期间发表论文情况 155 博士研究生在读期间参与科研项目情况 155-156 致谢 156-157 学位论文评阅及答辩情况表 157
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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 禾谷类作物 > 高粱
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