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过表达Ac转座酶对玉米内源性转座子的影响和玉米GRAS转录因子家族cDNA克隆及初步的功能分析

作　者: 侯绪刚
导　师: 安海龙
学　校: 山东农业大学
专　业: 细胞生物学
关键词: Ac-Ds转座子农杆菌转化基因枪法 GRAS转录因子家族短柄草
分类号: S513
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

玉米是世界上最重要的粮食作物和饲用作物，也是世界上分布最广泛的作物之一。在生物学和遗传学研究方面玉米具有雄厚的研究基础，特别是细胞遗传学方面取得了较快的进展。进行玉米分子遗传学研究的先决条件是获得一定的玉米变异材料，而玉米的特性决定了通过传统的突变体获得方法的艰难性。本论文通过农杆菌法和基因枪法探索玉米的遗传转化，通过过表达Ac转座酶来观察内源性Ds的拷贝数及转座频率变化并通过Ds大量的插入事件获得突变体。（1）农杆菌和基因枪法介导的玉米遗传转化方法的探索。我们以A188和齐-319自交系授粉后9-13天的玉米幼胚为材料、N6培养基为基本培养基进行组织培养转化。通过我们的瞬时表达实验结果表明，在侵染阶段我们选择侵染液OD值在0.8至1.0之间，幼胚46℃热激处理时间为6分钟，侵染时间为5分钟，共培养3天是比较合适的侵染方法。基因枪法是不同与农杆菌转化的另一种转化手段，我们对微弹制作的过程进行了优化，探索了适合我们自己体系的方法。目前亚精胺包裹的质粒基因枪转化瞬时表达效率在80%左右；使用鱼精蛋白能够略微减缓DNA在愈伤组织细胞内的降解速度；片段DNA进行的基因枪转化其DNA在细胞内的降解速度比质粒DNA略快，片段DNA基因枪瞬时表达效率在30%以上。（2）我们通过使用CaMV35S启动子驱动Ac转座酶在玉米中的过表达，可以有效的提高玉米中Ac-Ds转座子的转座频率。通过使用基因枪法分别转化P-35S::AcTPase::Tnos片段和Ds-GFP（Ds5’-P-ZmUbi::GFP::Tnos-Ds3’）片段，获得单拷贝植株及纯系种子，然后进行杂交，获得同时含有Ac转座酶和Ds-GFP的株系自交，这样就可产生大量的Ds插入事件。GRAS转录因子家族是植物所特有的一类转录因子，目前发现超过20多个种属的30多个物种含有能够编码GRAS蛋白的基因，该家族基因功能广泛，涉及根和分生组织的生长、光敏色素信号传导途径、赤霉素信号传导途径等多方面，此外该家族蛋白中还发现了与核定位信号有关的蛋白和与核定位信号序列相似的蛋白，这为GRAS蛋白作为转录因子调控基因的表达提供了有力的证据；目前该家族在拟南芥中发现33个家族成员，水稻中发现57个该家族成员。我们根据预测的玉米GRAS基因家族成员序列，对其进行了生物信息学分析，并设计引物对其进行克隆，通过转化短柄草来进行初步的功能预测。（1）玉米GRAS转录因子家族成员具有5个典型的GRAS结构域。GRAS基因具有5个典型的结构域：LHRⅠ、VHIID、LHRⅡ、PFYRE和SAW。我们发现该家族成员具有最保守的结构域VHIID，而其他结构域的保守性高的氨基酸也能够在该家族中发现，说明玉米GRAS转录因子家族具有典型的GRAS结构域。（2）玉米GRAS基因家族成员集中位于1、2、3、4、7、9和10这7条染色体上。我们通过MzizeGDB网站的在线Blast工具分析了该基因家族成员的染色体位置分布，发现该家族成员集中位于1、2、3、4、7、9和10这7条染色体上，而在5、6和8这3条染色体上则几乎没有分布。（3）玉米GRAS转录因子家族的亚家族分类。我们将拟南芥蛋白序列与玉米GRAS基因家族进行了同源性的比对，根据已知的拟南芥的GRAS蛋白的亚家族分类对玉米GRAS家族进行了初步分类，目前将其分为LISCL、PAT1、SHR、HAM、DELLA和SCR这6个亚家族。（4）农杆菌介导的玉米GRAS转录因子家族成员的短柄草转化。在玉米中，GRAS基因在茎、根、果穗、叶以及分生组织中都有表达；我们对其进行了基因克隆和载体构建，目前我们克隆到玉米GRAS基因家族成员有16个，构建了9个表达载体，并将其中的5个载体进行了短柄草转化，目前在T1代转基因植株中发现有ZmGRAS22有白化现象，ZmGRAS1有植株矮化的现象。

全文目录

中文摘要  9-11
Abstract  11-13
1 引言  13-28
  1.1 玉米背景介绍  13
  1.2 Ac-Ds 转座子  13-16
    1.2.1 玉米转座子的发现  13-14
    1.2.2 转座子的类型  14
    1.2.3 三种转座因子的特点  14
    1.2.4 Ac/Ds 转座子系统  14-15
    1.2.5 Ac/Ds 二元转座系统  15
    1.2.6 玉米内源 Ac/Ds 转座系统  15-16
  1.3 玉米转基因技术  16-22
    1.3.1 农杆菌转化技术  16-18
      1.3.1.1 Ti 质粒的分类  16
      1.3.1.2 Ti 质粒的结构和功能  16-17
      1.3.1.3 Ti 重组质粒的构建  17
      1.3.1.4 Ti 质粒转化过程  17-18
      1.3.1.5 Ti 质粒介导的转化技术  18
    1.3.2 基因枪法  18-22
      1.3.2.1 基因枪法的发展  19
      1.3.2.2 基因枪的优缺点  19-20
      1.3.2.3 基因枪转化的参数  20-21
      1.3.2.4 片段 DNA 基因枪转化  21
      1.3.2.5 基因枪共转化  21-22
  1.4 GRAS 转录因子研究进展  22-26
    1.4.1 转录因子  22-23
    1.4.2 GRAS 转录因子家族的命名  23
    1.4.3 GRAS 转录因子家族的分类  23
    1.4.4 GRAS 转录因子家族的蛋白结构特点  23-24
    1.4.5 GRAS 转录因子家族的功能  24-25
    1.4.6 GRAS 转录因子家族研究现状  25-26
  1.5 本研究的目的和意义  26-28
    1.5.1 过表达 Ac 转座酶对玉米内源性转座子的影响  26-27
    1.5.2 玉米 GRAS 转录因子家族 cDNA 克隆及初步的功能分析  27-28
2 材料和方法  28-43
  2.1 实验材料  28-30
    2.1.1 植物材料和种植  28
    2.1.2 菌株和质粒  28
    2.1.3 酶及生化试剂  28
    2.1.4 PCR 引物  28-30
    2.1.5 培养基  30
  2.2 试验方法  30-43
    2.2.1 取材及 RNA 提取与反转录  30-32
      2.2.1.1 Trizol 法提取 RNA  30-31
      2.2.1.2 反转录 cDNA 的合成  31-32
    2.2.2 质粒 DNA 的提取和片段 DNA 的制备  32-33
      2.2.2.1 小量碱法提质粒  32
      2.2.2.2 百泰克试剂盒小量质粒提取  32-33
      2.2.2.3 基因枪用片段制备  33
    2.2.3 大肠杆菌和农杆菌感受态制备及转化  33-34
      2.2.3.1 大肠杆菌感受态制备  33
      2.2.3.2 热激法转化大肠杆菌感受态  33-34
      2.2.3.3 农杆菌感受态制备  34
      2.2.3.4 冻融法转化农杆菌感受态  34
    2.2.4 载体构建  34-36
      2.2.4.1 PCR 扩增目的片段  34-35
      2.2.4.2 连接反应  35
      2.2.4.3 酶切与回收  35-36
      2.2.4.4 表达载体构建  36
    2.2.5 农杆菌侵染法介导的玉米遗传转化  36-38
      2.2.5.1 农杆菌的培养和处理  36-37
      2.2.5.2 幼胚的处理  37
      2.2.5.3 侵染与共培养  37
      2.2.5.4 筛选阶段  37
      2.2.5.5 转基因植株再生  37-38
      2.2.5.6 转基因植株的鉴定  38
    2.2.6 基因枪法玉米遗传转化  38-41
      2.2.6.1 基因枪设备  38
      2.2.6.2 基因枪质粒的制备（百泰克小量试剂盒）  38
      2.2.6.3 基因枪 DNA 片段制备  38-39
      2.2.6.4 基因枪微弹制作  39-40
      2.2.6.5 基因枪转化  40-41
      2.2.6.6 转化愈伤组织的筛选和植株再生  41
      2.2.6.7 转基因植株的鉴定  41
    2.2.7 农杆菌介导的短柄草转化  41-43
      2.2.7.1 愈伤组织诱导  41-42
      2.2.7.2 农杆菌侵染愈伤组织  42
      2.2.7.3 转基因植株鉴定  42-43
3 结果和分析  43-63
  3.1 过表达 Ac 转座酶对玉米内源性转座子的影响  43-55
    3.1.1 载体构建及片段 DNA 制备  43-44
    3.1.2 玉米取胚及愈伤组织诱导  44-45
    3.1.3 农杆菌介导的玉米转化  45-50
      3.1.3.1 农杆菌瞬时表达实验  45-47
      3.1.3.2 农杆菌侵染转化幼胚  47-50
    3.1.4 基因枪法玉米转化  50-55
      3.1.4.1 基因枪瞬时表达实验  50-52
      3.1.4.2 鱼精蛋白与片段基因枪转化的探索  52-55
  3.2 玉米 GRAS 转录因子家族 cDNA 克隆及初步的功能分析  55-63
    3.2.1 玉米 GRAS 转录因子家族保守序列分析  55-57
    3.2.2 玉米 GRAS 转录因子家族基因染色体位置  57
    3.2.3 玉米 GRAS 亚家族分类  57-59
    3.2.4 玉米 GRAS 基因成员表达部位的分析  59-60
    3.2.5 玉米 GRAS 基因成员的克隆及植物表达载体构建  60-61
    3.2.6 农杆菌介导的短柄草转化  61-62
    3.2.7 转基因植株的鉴定及表型分析  62-63
4 讨论  63-67
  4.1 过表达 Ac 转座酶对玉米内源性转座子的影响  63-65
    4.1.1 农杆菌介导的玉米转基因技术的研究  63
    4.1.2 基因枪法转化技术的研究  63-64
    4.1.3 瞬时表达实验 GFP 荧光标记  64-65
  4.2 玉米 GRAS 转录因子家族 cDNA 克隆及初步的功能分析  65-67
    4.2.1 玉米 GRAS 转录因子家族保守序列的分析  65
    4.2.2 玉米 GRAS 转录因子家族成员染色体分布及分类  65
    4.2.3 玉米 GRAS 家族成员的克隆  65-66
    4.2.4 短柄草转化及表型  66-67
5 结论  67-68
  5.1 过表达 Ac 转座酶对玉米内源性转座子的影响  67
  5.2 玉米 GRAS 转录因子家族 cDNA 克隆及初步的功能分析  67-68
参考文献  68-75
致谢  75

过表达Ac转座酶对玉米内源性转座子的影响和玉米GRAS转录因子家族cDNA克隆及初步的功能分析

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