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小麦组蛋白变体的克隆及小麦叶绿体蛋白组比较

作　者: 李永超
导　师: 夏光敏
学　校: 山东大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 小麦组蛋白变体非生物胁迫叶绿体蛋白组学
分类号: S512.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

盐、旱等逆境胁迫是农作物减产的主要因素。研究作物耐逆机理、分离耐逆基因、培育耐逆作物新品种是应对逆境胁迫的有效途径。植物非生物胁迫应答是由众多基因组成的信号网络在遗传学和表观遗传学水平进行协同调控,系统改变叶绿体及其他细胞器的生理活性而实现的。本实验以小麦渐渗系耐盐抗旱品种山融3号(SR3)及其亲本普通小麦济南177(JN177)为材料,一方面分析了表观遗传调控相关的组蛋白变体与小麦盐胁迫应答的关系,另一方面进行了叶绿体蛋白质组分析,进一步认识SR3的耐逆能力与叶绿体的关系。一、SR3和JN177组蛋白变体基因的克隆和耐逆功能分析组蛋白是一类进化上高度保守的蛋白,是构成核小体的主要成分。组蛋白变体是特殊状态下染色体组装所需的组蛋白类型,一般通过替换常规组蛋白导致染色体重塑进入核小体,能在表观遗传学水平调控基因的转录。本实验室前期转录组分析发现,一系列注释为组蛋白变体的探针在盐胁迫下表达发生明显变化,而且部分探针的表达量在SR3和JN177间存在显著差异,暗示组蛋白变体在植物耐逆应答过程中发挥重要作用。本实验根据转录组结果,克隆了8个组蛋白变体基因,包括H2A变体TaH2A-1～4和TaH2A.Z-1、H3变体TaH3-1～2、H4变体TaHH4-1。这些基因的cDNA和基因组序列在SR3和JN177间均分别相同,其中TaH2A-4和TaHH3-2含有1个内含子。它们的氨基酸序列含有典型的α-螺旋结构和核定位信号,亚细胞定位分析显示这些变体定位于细胞核。RT-PCR分析发现,这些基因均具有盐胁迫响应表达特征,并且有些只在根中表达。为了验证其生物学功能,我们将五个变体基因转化到拟南芥,其中TaH2A-2、 TaH2A-3和TaH2A.Z-1能正常表达。结果发现,这些基因的过表达系和野生型在整个生长周期中均没有明显差异。在NaCl、H2O2、甘露醇和各种激素处理下,TaH2A-2和TaH2A.Z-1过表达株系与野生型的萌发率、植株叶片大小和根长均没有显著性差异。NaCl、NAA、ACC、GA3处理下,TaH2A-3过表达株系与对照的萌发率、植株叶片大小和根长也没有显著性差异。但与野生型相比,TaH2A-3过表达株系的抗旱能力增强,抗氧化能力降低,甘露醇处理下侧根数目减少,ABA处理下萌发延迟。这些结果显示,不同组蛋白变体在抗逆中的作用存在显著差异,而这种差异可能源于它们在染色体重塑中的作用机制差异,TaH2A-2和TaH2A.Z-1需要通过核小体组装协同作用因子才能被招募到染色体上而TaH2A-3则不需要,或者TaH2A-2和TaH2A.Z-1被招募到染色体上发挥与拟南芥同源蛋白相似的功能而TaH2A-3则发挥不一样的功能。二、SR3和JN177叶绿体蛋白质组分析叶绿体是植物细胞中进行光合作用的场所,是植物进行自养生存的关键。实验室前期蛋白质组学分析发现,SR3的旺盛生长和抗性与叶绿体同化能力相关。为了进一步认识这一关系,本试验开展了叶绿体蛋白组学分析。我们改进了小麦叶绿体提取方法,获得了纯度较高的叶绿体。通过双向电泳,得到了28个差异表达的蛋白点,其中正常条件下SR3和JN77间差异的18个(JN177中表达量高的8个,表达量低的10个),NaCl胁迫下两者间差异的2个,正常和NaCl胁迫间差异的8个。经MALDI-TOF质谱和MALDI-TOF-TOF质谱鉴定了21个差异蛋白点,主要包括光合作用相关蛋白、光合系统稳定相关蛋白及蛋白质合成/转运相关蛋白。其中,卡尔文循环中关键酶磷酸核酮糖激酶和核酮糖二磷酸羧化酶多个亚基的含量在SR3和JN177间存在差异；光合作用系统稳定性相关的2-半胱氨酸过氧化物酶BAS1、释放氧增强蛋白、光系统Ⅱ的稳定／装配因子HCF136在SR3中表达量明显增加。这些差异可能导致了SR3和JN177在正常和胁迫条件下光合同化效率的不同,为进一步分析SR3具有较强的耐逆性提供了线索。

全文目录

摘要  6-8
ABSTRACT  8-10
符号说明  10-11
第一章文献综述  11-19
  1.1 非生物胁迫及植物的应答机制  11-14
    1.1.1 高盐胁迫与植物的生长发育  11-12
    1.1.2 旱胁迫与植物的生长发育  12
    1.1.3 温度与植物的生长发育  12-14
  1.2 组蛋白及组蛋白变体  14-16
  1.3 组蛋白变体与植物非生物胁迫  16
  1.4 叶绿体蛋白质组学  16-19
    1.4.1 叶绿体  16-17
    1.4.2 叶绿体蛋白质组学  17-19
第二章小麦组蛋白变体基因的克隆和功能分析  19-46
  引言  19
  一、材料和方法  19-23
    1. 实验材料及试剂  19-20
      1.1 植物材料  19
      1.2 菌种和载体  19
      1.3 试剂及配制方法  19-20
    2. 实验方法  20-23
      2.1 小麦组蛋白变体基因cDNA全长克隆  20
      2.2 小麦组蛋白变体基因的基因组序列克隆  20-21
      2.3 基因的表达模式分析  21
      2.4 基因的亚细胞定位  21
      2.5 构建组蛋白变体过表达拟南芥  21-22
      2.6 拟南芥表型分析  22-23
  二、结果和分析  23-43
    1. 芯片中小麦组蛋白变体基因的表达特征  23-25
    2. 小麦组蛋白变体基因的克隆  25-27
    3. 组蛋白变体基因的盐胁迫应答模式分析  27-28
    4. 小麦组蛋白变体化学特性分析  28-29
    5. 小麦组蛋白变体结构分析  29-31
    6. 小麦组蛋白变体进化树分析  31-32
    7. 小麦组蛋白变体的亚细胞定位  32-34
    8. 组蛋白变体的功能分析  34-36
      8.1 组蛋白变体拟南芥过表达载体的构建  34-36
      8.2 拟南芥的转化及纯系筛选  36
    9. 不同非生物胁迫下组蛋白变体转基因拟南芥的表型分析  36-43
  三、讨论  43-46
第三章小麦叶绿体蛋白质组分析  46-62
  引言  46
  一、材料和方法  46-49
    1. 实验材料及试剂  46-47
      1.1 植物材料  46
      1.2 药品及其相关配制  46-47
    2. 实验方法  47-49
      2.1 处理方法  47-48
      2.2 叶绿体的分离  48
      2.3 叶绿体纯度鉴定  48-49
      2.4 叶绿体蛋白的提取及溶解  49
      2.5 双向电泳  49
      2.6 双向电泳凝胶的固定及染色  49
      2.7 差异蛋白比较和鉴定  49
  二、结果和分析  49-59
    1. 小麦叶绿体分离和纯度鉴定  49-51
    2. 蛋白组双向电泳结果  51-55
    3. 小麦叶绿体差异表达蛋白质鉴定  55-59
  三、讨论  59-62
附录  62-63
参考文献  63-67
致谢  67

小麦组蛋白变体的克隆及小麦叶绿体蛋白组比较

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