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小麦渐渗系山融3号转录因子TaNAC6A的克隆、表达及功能研究

作　者: 张凌霄
导　师: 夏光敏
学　校: 山东大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 小麦 TaNAC6A 基因的结构与功能
分类号: S512.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


一直以来,植物生长都面临干旱、低温、高盐和病虫害感染等生物及非生物胁迫。为了应对这些危害,植物在形态及生化特性方面进化出一系列特质,以适应客观环境的恶劣条件。植物抗胁迫的复杂反应机制依靠一系列调节基因完成,这些调节基因用于编码功能性蛋白或调节蛋白。这些基因调节机制中最典型的一类就是转录因子调节机制。转录因子通过信号级联来响应环境刺激,并且通过直接的相互作用,或通过与其他蛋白质的结合,结合特异的DNA序列,以此发挥作用。本实验室利用不对称体细胞杂交技术,得到普通小麦济南177(Triticum aestivum L.2n=42)与其强耐盐性近缘属长穗偃麦草(Thinopyrum ponticum2n=70)的杂种耐盐渐渗系新品种山融3号(SR3)。遗传及生理生化分析结果表明,耐盐新品种山融3号基因组中含有长穗偃麦草染色体的小片段,而其包括耐盐指标在内的各项生理生化指标均优于其亲本。山融3号耐盐性状是由一个主效基因位点和多个微效基因位点共同控制的。本实验依据山融3号和亲本JN177在NaCl和PEG胁迫下基因差异表达的芯片信息,从山融3号盐肋迫的全长cDNA文库中克隆得到一个对于高盐、干旱等非生物肋迫及ABA响应的转录因子基因TaNAC6A,并对其进行了初步的研究和鉴定。该基因全长900个碱基,编码299个氨基酸,其编码的蛋白包含一个高度保守的N-端结构域和一个高度活跃的C-端结构域,其中的N-端结构域是DNA结合域(又叫NAC域),C-端结构域是转录激活区域。RT-PCR分析结果显示：在盐处理、过氧化氢处理及ABA处理后,该基因均有明显上调趋势。体外转录活性激活实验显示：该基因的全长序列具有转录激活活性。亚细胞定位实验结果表明,该基因编码的蛋白质定位于细胞核中,是一种核定位蛋白。构建植物表达载体并转入模式植物拟南芥中,得到过表达转基因纯系。过表达系在生长发育过程中表现出延迟发育、提前开花、荚果短小、植株矮小以及卷叶等现象。另外经过NaCl、H2O2、ABA处理后转基因株系具有更强的抗胁迫能力,而控水实验结果表明转基因株系在旱胁迫条件下比野生型具有更强的抗旱能力。为了深入了解TaNAC6A基因对于非生物胁迫及激素的响应机制,本实验克隆了SR3中TaNAC6A基因的一段启动子序列,并且在分析该段序列后发现,除了一些必需元件以外,该段启动子中还含有一些如MBS结合位点、ABRE结合位点的胁迫响应元件,从而从启动子的角度上证明了该基因能够参与多种非生物胁迫的响应过程。为了进一步了解该基因引起叶片卷曲及抗逆性的可能作用机制,我们进行了细胞壁合成及抗逆Marker基因的实时定量PCR实验,实验结果表明,与抗性相关的RD29B基因在转基因植株中表达量上调明显,而与细胞壁形成相关的基因如FRA8等,较之野生型也均表现出明显的变化趋势。以上实验结果显示,TaNAC6A是一个与抗胁迫相关的转录因子,同时它对于植株的生长发育也会产生较大影响。

全文目录


目录  4-8
摘要  8-10
Abstract  10-12
第一章 文献综述  12-30
  1. 植物非生物胁迫的应答机制  13-18
    1.1 非生物胁迫对植物的影响  13-15
      1.1.1 盐胁迫对植物的影响  13-14
      1.1.2 旱胁迫对植物的影响  14-15
    1.2 植物的应激响应  15-16
      1.2.1 调整渗透调节  16
      1.2.2 调节细胞膜  16
      1.2.3 增强抗氧化能力  16
    1.3 非生物胁迫下的信号转导及相关基因的调控  16-18
  2. 植物抗逆相关转录因子  18-21
    2.1 植物转录因子的结构  18
    2.2 植物转录因子相关功能  18-20
    2.3 高等植物转录因子的分类  20-21
  3. NAC转录因子  21-30
    3.1 NAC转录因子的起源与分类  21-23
      3.1.1 NAC转录因子的起源  21-22
      3.1.2 NAC蛋白的分类  22-23
    3.2 NAC转录因子的发现及其分布、结构特点  23-24
      3.2.1 NAC转录因子的发现  23
      3.2.2 NAC转录因子在生物体中的分布  23
      3.2.3 NAC转录因子的结构特征  23-24
    3.3 NAC转录因子参与植物的生长发育过程  24-26
      3.3.1 NAC转录因子参与植物种子萌发  24
      3.3.2 NAC转录因子参与植物细胞分裂  24-25
      3.3.3 NAC转录因子参与植物细胞的次生壁合成  25
      3.3.4 NAC转录因子参与植物开花  25-26
      3.3.5 NAC转录因子参与植物衰老过程  26
      3.3.6 NAC转录因子对Fe元素平衡的调节作用  26
    3.4 NAC转录因子参与多种逆境胁迫的响应  26-28
    3.5 NAC转录因子的表达调控  28-30
      3.5.1 转录调控  28
      3.5.2 转录后的调控  28
      3.5.3 翻译后调控  28-30
第二章 研究工作  30-58
  引言  30
  一、实验材料  30-37
    1.材料及生长条件  30-32
      1.1 植物材料及生长条件  30-31
      1.2 胁迫处理条件及发育期的选择  31-32
        1.2.1 小麦发育期选择及各种处理条件  31
        1.2.2 拟南芥发育期选择及胁迫处理条件  31-32
    2 菌株和载体质粒  32-33
    3 药品试剂、主要溶液、培养基及其配制  33-37
      3.1 药品试剂  33-34
      3.2 主要溶液及配制  34-35
      3.3 培养基及其配制  35-37
  二、实验方法  37-58
    1. 小麦TaNAC6A基因cDNA全长的克隆与序列分析  37-40
      1.1 TRIZOL法提取小麦总RNA  37-38
      1.2 总RNA的纯化  38
      1.3 RNA反转录及第一链cDNA合成  38-39
      1.4 片段的酶切与连接  39
      1.5 大肠杆菌感受态制备  39
      1.6 大肠杆菌转化  39-40
      1.7 转化子鉴定  40
      1.8 序列分析  40
    2. 基因表达模式分析  40-42
      2.1 小麦目的基因表达模式分析  40-41
      2.2 拟南芥相关Marker基因表达模式分析  41-42
    3. 基因亚细胞定位实验  42-47
      3.1 瞬时表达载体的构建  42
      3.2 碱裂解法提取质粒DNA  42-43
      3.3 琼脂糖凝胶DNA条带的回收  43
      3.4 无内毒素的质粒提取  43-45
      3.5 PEG介导的小麦原生质体转化  45-46
      3.6 洋葱表皮细胞基因枪转化法  46-47
    4. 原核表达  47-48
      4.1 cDNA序列扩增  47
      4.2 目的基因的pET-32a载体构建  47-48
      4.3 重组酶在E.coli BL21中的重组表达  48
    5. 转录因子体外活性分析  48-50
      5.1 目的基因的获得及载体构建  48-49
      5.2 酵母感受态的制备  49
      5.3 小量法转化酵母感受态及体外转录活性鉴定  49-50
    6. 过表达转基因拟南芥株系的获得  50-53
      6.1 过表达载体的构建  50
      6.2 农杆菌EHA105感受态制备  50
      6.3 冻融法转化根癌农杆菌EHA105  50-51
      6.4 拟南芥转化  51
      6.5 转基因拟南芥阳性株系的筛选与鉴定  51-52
      6.6 过表达拟南芥表型分析  52-53
        6.6.1 种子萌发实验  52
        6.6.2 根的伸长实验  52-53
        6.6.3 旱胁迫处理实验  53
    7. 启动子克隆及分析  53-58
      7.1 小麦基因组DNA的提取  53-54
      7.2 构建小麦BD Genome Walker库  54-55
      7.3 巢式PCR  55-56
      7.4 启动子序列分析  56-58
第三章 结果分析  58-82
  1. 小麦TaNAC6A基因对应探针在芯片数据库中的表达变化情况  58-59
  2. TaNAC6A cDNA的克隆与序列分析  59-61
  3. 非生物胁迫与激素处理条件下TaNAC6A的表达模式  61-62
  4. TaNAC6A的体外转录激活实验  62-64
    4.1 酵母表达载体的构建  62-63
    4.2 TaNAC6A的体外转录激活实验  63-64
  5. TaNAC6A亚细胞定位  64-65
  6 原核表达  65-66
  7. 拟南芥TaNAC6A过表达株系的获得  66-69
    7.1 拟南芥过表达载体的构建  66-68
    7.2 拟南芥过表达株系的获取  68-69
  8. 拟南芥TaNAC6A过表达株系的表型实验  69-77
    8.1 过表达TaNAC6A基因提高抗盐性  69-71
    8.2 过表达TaNAC6A基因对ABA的响应  71-73
    8.3 过表达TaNAC6A基因对GA的响应  73-74
    8.4 过表达TaNAC6A基因植株抗旱能力的提高  74-75
    8.5 过表达TaNAC6A基因植株的生长发育特征  75-77
  9. TaNAC6A启动子克隆及结果分析  77-79
  10. TaNAC6A过表达植株相关Marker基因的表达分析  79-82
讨论  82-84
结论  84-86
参考文献  86-95
发表论文  95
申请专利  95-96
致谢  96-97
学位论文评阅及答辩情况表  97

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 禾谷类作物 > 麦 > 小麦
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