学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

普通菜豆镰孢菌枯萎病抗病种质鉴定及抗病机理研究

作　者: 薛仁风
导　师: 王述民; 朱振东
学　校: 中国农业科学院
专　业: 作物种质资源学
关键词: 普通菜豆镰孢菌枯萎病抗性种质资源互作研究水杨酸
分类号: S436.43
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
下　载: 240次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

普通菜豆是人类主要食用豆类作物之一，营养价值高，栽培面积大。但在菜豆栽培生产中，尖镰孢菌枯萎病一直是菜豆生产中严重的病害，给菜豆生产带来较大损失。因此，筛选具有稳定抗性的菜豆种质资源，揭示普通菜豆镰孢菌枯萎病的抗病机理，发掘并利用优异的抗病基因，改良普通菜豆抗病性，对保障我国食物安全、提高菜豆生产的经济效益具有重要的理论和现实意义。本研究根据普通菜豆枯萎病原菌（Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli）中与其致病力密切相关的一个转录因子基因（ftf1基因）设计了一对特异性引物，结合荧光定量PCR技术能够准确区分抗病性不同的菜豆种质，通过cDNA-AFLP技术揭示了普通菜豆与病原菌互作过程中的差异表达基因，克隆了2个寄主防御反应相关基因，钙调素基因PvCaM1和过氧化物酶基因PvPOX1，并通过外源激素诱导的方法探索菜豆抗病信号传导途径及其抗病机理，以期为普通菜豆抗镰孢菌枯萎病抗性遗传改良提供基因资源和理论依据。获得如下结果：1.从全国6个省的8个地点采集的病株上分离病原菌，通过形态学鉴定得到59株尖镰孢菌，并从致病性和分子生物学方面鉴定出致病菌37株。根据F. oxysporum f. sp. phaseoli中ftf1基因设计了一对特异性引物QFopA/QFopB，该引物组合只能在F. oxysporum f. sp. phaseoli中扩增到一个149bp的片段，因此可以用于准确鉴定菜豆枯萎病原菌，从而为定量地筛选抗性较好的菜豆种质资源奠定了基础。2.利用枯萎病原菌FOP-DM01菌株，比较了玉米粉接种体法、下胚轴双孔注射法及接种体蘸根法的接种效果，选用玉米粉接种体法从362份普通菜豆种质资源中鉴定出抗病种质16份，其中2份抗性较好，品种名称分别为260205和黑芸豆，统一编号分别为：F0005035和F0004851。利用F. oxysporum f. sp. phaseoli特异性引物QFopA/QFopB并结合荧光定量PCR技术，最低能够检测到1pg的病原菌DNA，通过对感病菜豆品种BRB-130，A0640-1和抗病菜豆品种260205，黑芸豆根和茎中病原菌的定殖量进行分析，结果表明，接种病原菌6d后，BRB-130和A0640-1根中的定殖量均显著高于病原菌在260205和黑芸豆中的定殖量。3.通过cDNA-AFLP技术揭示了感病材料BRB-130和抗病材料260205分别与FOP-DM01菌株互作中差异表达基因，共获得443个差异表达片段，其中172个已经测序，测序的片段其中包括许多植物抗病相关基因，如：生长素调节蛋白（GH3auxin-regulated protein）、钙调素蛋白（calmodulin）、过氧化物酶（peroxidase）等，并通过荧光定量PCR技术验证差异表达基因在互作过程中表达量的变化；扫描电镜（Scanning electron micrographs, SEM）和透射电镜（Transmissionelectron micrographs, TEM）观察结果显示，BRB-130根和茎的组织结构和细胞结构被病原菌严重破坏，而260205根和茎被病原菌浸染后组织结构基本正常；260205被病原菌侵染后根和茎中苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia lyase, PAL）和过氧化物酶（Peroxidase, POX）的活性要显著高于BRB-130，表明这两种植物防御相关酶在菜豆抗病反应中发挥重要的作用。此外对菜豆根和茎中H₂O₂和O₂^-的含量进行了测定，结果表明，260205被病原菌侵染后根和茎中H₂O₂和O₂^-的含量均高于BRB-130，说明活性氧（ROS）在菜豆抗镰饱菌枯萎病抗性反应中同样具有重要的作用。4.利用表达序列标签（EST）克隆了含有编码普通菜豆CaM基因，命名为PvCaM1（JN418801），同源分析结果显示，PvCaM1基因与百脉根、西瓜的CaM基因亲缘关系最近，分别达到77%和76%。荧光定量PCR分析表明，PvCaM1基因受FOP-DM01菌株诱导表达，而且叶中的表达量高于根和茎中的表达量。PvCaM1基因表达量也受外源植物激素脱落酸（ABA）、茉莉酸甲酯（MeJA）和乙烯利（ETH）诱导上调，在根、茎、叶中均有不同程度的表达，其中叶中表达量最高。5.利用EST克隆了含有编码普通菜豆POX基因，命名为PvPOX1（JQ627838），同源分析结果显示，PvPOX1与大豆POX基因的亲缘关系最近，达到90%，与苜蓿次之，达85%。荧光定量PCR分析表明，在根和茎中PvPOX1基因均受FOP-DM01菌株显著诱导表达，并且伴随着POX活性的显著增强及H₂O₂含量的升高，PvPOX1基因表达量的升高与POX活性及H₂O₂含量的变化具有明显的相关性。PvPOX1基因在根、茎、叶、花和荚中均有不同程度的表达，叶中最低，荚中最高。PvPOX1基因表达量也受水杨酸（SA）和ABA等植物激素及机械损伤、盐、干旱等非生物胁迫诱导表达。6.采用SA、MeJA、ETH、多效唑（Paclobutrazol）和去甲二氢愈创木酸（NDGA）等化学药品处理菜豆BRB-130，结果表明SA处理菜豆叶片使植株根中内源SA的含量升高，并显著提高植株对枯萎病原菌FOP-DM01菌株的抗病性。此外，SA能够显著地诱导菜豆SAR反应，从而降低了FOP-DM01菌株在菜豆根中增殖能力，体外实验结果表明，SA对FOP-DM01菌株并没有直接的抑菌活性；另外，SA诱导菜豆根组织中PAL和POX活性和H₂O₂和O₂^-的含量显著升高，从而诱导菜豆产生HR和SAR反应，增强了菜豆对FOP-DM01菌株的抗性。

全文目录

摘要  6-8
Abstract  8-15
英文缩略表  15-16
第一章文献综述  16-44
  1.1 普通菜豆镰孢菌枯萎病研究现状  16-19
    1.1.1 分布与危害  16
    1.1.2 症状  16
    1.1.3 病原  16-18
    1.1.4 侵染循环  18
    1.1.5 发病规律  18
    1.1.6 防治技术  18-19
  1.2 普通菜豆镰孢菌枯萎病国内外研究进展  19-21
    1.2.1 普通菜豆镰孢菌枯萎病抗病种质资源的筛选与鉴定  19
    1.2.2 普通菜豆镰孢菌枯萎病抗病基因（R基因）的研究进展  19-21
  1.3 荧光定量技术在植物病原真菌鉴定及抗病性分析中的应用  21-29
    1.3.1 实时荧光定量PCR的原理及优点  21-22
    1.3.2 非特异性荧光染料  22
    1.3.3 特异性荧光探针  22-23
    1.3.4 荧光定量技术在植物病原真菌鉴定方面的应用  23-28
    1.3.5 实时荧光定量PCR技术在植物抗病性鉴定中的应用  28-29
  1.4 CDNA-AFLP技术的原理及其应用  29-33
    1.4.1 cDNA-AFLP技术的原理与方法  29-30
    1.4.2 cDNA-AFLP技术的优点  30-31
    1.4.3 cDNA-AFLP技术的应用  31-33
  1.5 植物抗病性及其信号的转导途径  33-42
    1.5.1 植物的抗病反应  33-34
    1.5.2 植物抗病反应中的内源信号分子  34-40
    1.5.3 信号分子之间的相互关系  40-42
  1.6 本研究的目的意义和技术路线  42-44
    1.6.1 研究目的和意义  42
    1.6.2 技术路线  42-44
第二章普通菜豆镰孢菌枯萎病原菌的分离与鉴定  44-52
  2.1 材料与方法  44-48
    2.1.1 实验材料  44
    2.1.2 病原菌的分离  44
    2.1.3 真菌分离物的鉴定  44-48
  2.2 结果与分析  48-51
    2.2.1 真菌分离物形态学观察  48-49
    2.2.2 尖镰孢菌株致病性的测定  49
    2.2.3 真菌分离物分子生物学鉴定  49-50
    2.2.4 F. oxysporum f. sp. phaseoli检测引物的设计及特异性检测  50-51
  2.3 讨论  51-52
第三章普通菜豆镰孢菌枯萎病抗病种质资源的筛选  52-63
  3.1 材料与方法  52-57
    3.1.1 供试菌株  52
    3.1.2 供试菜豆  52
    3.1.3 抗性鉴定：玉米粉接种体法  52-54
    3.1.4 抗性鉴定：下胚轴双孔注射法  54-55
    3.1.5 抗性鉴定：接种体蘸根法  55
    3.1.6 应用荧光定量PCR技术分析普通菜豆不同品种间抗病性的差异  55-57
  3.2 结果与分析  57-61
    3.2.1 三种病原菌接种方法的比较  57-58
    3.2.2 玉米粉接种体法筛选 362 份菜豆资源  58
    3.2.3 应用荧光定量PCR技术区分不同菜豆品种间的抗病性差异  58-61
  3.3 讨论  61-63
第四章普通菜豆与枯萎病原菌互作研究  63-87
  4.1 材料和方法  63-70
    4.1.1 实验材料  63
    4.1.2 菜豆根和茎的组织学和细胞学观察  63-64
    4.1.3 植物抗病相关防御酶活的测定  64
    4.1.4 植物H_2O_2和O_2~-含量的测定  64-65
    4.1.5 cDNA-AFLP技术分析病原菌与寄主互作中的差异表达基因  65-70
  4.2 结果与分析  70-83
    4.2.1 表型鉴定及组织学观察  70-75
    4.2.2 PAL和POX活性的测定  75-76
    4.2.3 H_2O_2与O_2~-含量的测定  76-78
    4.2.4 cDNA-AFLP技术分析差异表达片段  78-83
  4.3 讨论  83-87
第五章普通菜豆镰孢菌枯萎病抗病相关基因PvCaM1 的克隆及表达分析  87-101
  5.1 材料和方法  87-94
    5.1.1 试验材料  87
    5.1.2 病原菌的接种与化学信号分子处理  87
    5.1.3 总RNA的提取与cDNA合成  87
    5.1.4 PvCaM1 基因的克隆  87-93
    5.1.5 PvCaM1 序列分析  93
    5.1.6 cDNA第一链的合成  93
    5.1.7 实时荧光定量PCR分析基因表达量  93-94
  5.2 结果与分析  94-100
    5.2.1 总RNA的提取  94
    5.2.2 PvCaM1 基因的克隆和序列分析  94-97
    5.2.3 PvCaM1 基因的诱导表达分析  97-100
  5.3 讨论  100-101
第六章普通菜豆镰孢菌枯萎病抗病相关基因PvPOX1 的克隆及表达分析  101-113
  6.1 材料和方法  101-103
    6.1.1 试验材料  101
    6.1.2 生物胁迫与非生物胁迫处理  101
    6.1.3 总RNA的提取与cDNA合成  101-102
    6.1.4 PvPOX1 基因的克隆  102
    6.1.5 PvPOX1 序列分析  102
    6.1.6 cDNA第一链的合成  102
    6.1.7 实时荧光定量PCR分析PvPOX1 基因表达量  102-103
    6.1.8 过氧化物酶(POX)活性的测定  103
    6.1.9 过氧化氢(H_2O_2)含量的测定  103
  6.2 结果与分析  103-111
    6.2.1 总RNA的提取  103
    6.2.2 PvPOX1 基因的克隆和序列分析  103-107
    6.2.3 PvPOX1 基因的表达分析  107-110
    6.2.4 POX活性的测定  110-111
    6.2.5 H_2O_2含量的测定  111
  6.3 讨论  111-113
第七章水杨酸诱导的普通菜豆抗病性反应  113-124
  7.1 材料与方法  113-115
    7.1.1 实验材料  113
    7.1.2 化学药品处理  113
    7.1.3 病原菌的接种与检测样本的采集  113-114
    7.1.4 菜豆发病情况的调查  114
    7.1.5 PAL和POX酶活性的测定  114
    7.1.6 H_2O_2和O_2~-含量的测定  114
    7.1.7 菜豆根中游离SA的定量分析  114-115
    7.1.8 荧光定量PCR验证病原菌定殖量  115
    7.1.9 化学信号分子抑菌活性的测定  115
  7.2 结果与分析  115-121
    7.2.1 不同化学药品对菜豆抗病性的影响  115-117
    7.2.2 SA诱导菜豆镰孢菌枯萎病抗病性  117-118
    7.2.3 PAL和POX酶活的测定  118
    7.2.4 H_2O_2和O_2~-含量的测定  118-119
    7.2.5 菜豆根中游离SA的定量分析  119-120
    7.2.6 荧光定量PCR验证病原菌定殖量  120-121
    7.2.7 化学药品抑菌活性的测定  121
  7.3 讨论  121-124
第八章全文结论  124-126
参考文献  126-147
附表  147-170
致谢  170-171
作者简历  171

普通菜豆镰孢菌枯萎病抗病种质鉴定及抗病机理研究

内容摘要

全文目录

相似论文