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辣椒疫病生防ASD菌株筛选及对土壤微生态调控机理研究

作　者: 王辉
导　师: 孙军德; 刘长远
学　校: 沈阳农业大学
专　业: 农业环境与生态
关键词: 辣椒疫病生防菌筛选 ASD菌株控病机理优势微生物土壤微生态调控
分类号: S436.418
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

辣椒疫病(Phytophthora capsici)是保护地辣椒生产上造成产量损失极大的土传病害。由于连作、大水漫灌和化学药剂频繁使用,常导致保护地土壤中该病菌菌源积累增大、农药污染加重,微生态环境易遭到破坏。目前生产上缺少生防菌剂产品,缺乏有效的生物防治措施。本文以辽宁省辣椒疫病为研究对象,开展了辣椒疫霉病菌遗传多样性、生防菌和微生态调控研究,取得如下结果：1.通过形态学和rDNA-ITS同源性分析表明,来源于辽宁省不同地区辣椒疫病病菌形态学相似,菌丝多为直角或锐角分枝,孢子囊梗无色、丝状,孢子囊单孢、卵圆形或梨形,乳突单生；病菌rDNA-ITS序列805-877bp。聚类分析表明,辽宁省不同地区的辣椒疫病菌表现出较高的同源性,无区域性差异。2.通过SRAP技术对病菌遗传多样性分析表明,不同地区辣椒疫病病菌的群体遗传相似性很高,具出丰富的多态性,但区域性差异不明显；致病力测定表明,辽宁省辣椒疫病菌存在11种致病力类型,主要以中等致病力为主,致病力增强风险较大。辣椒疫病菌致病力与遗传相似性无明显相关性。3.采用平板稀释法分离辣椒生产田56份土样,对获得的微生物进行对峙抑菌试验,得到对辣椒疫病菌有明显的拮抗作用的ASD菌株,其抑菌带达11.7mm。盆栽试验防治效果可达75.12%,优于80%代森锰锌可湿性粉剂300mg/L、50%烯酰吗啉水分散粒剂20mg/L。4.形态学及分子鉴定结果表明,ASD菌株在PDA培养基上菌落丝绒状,菌丝初为白色至土黄色,偶有透明液渗出。分生孢子顶囊为辐射形,分生孢子球形,有小梗及链状排列的分生孢子；测定ASD菌株rDNA-ITS序列为621bp,与黄柄曲霉序列相似度达97%,确认ASD菌株为黄柄曲霉菌(Aspergillus flavipes)。5.控病机理研究表明,生防菌ASD菌株可产生抑菌物质,可致病菌菌丝畸形,抑制病菌生长。加入疫病菌丝可诱导CMC酶活性、木聚糖酶活性显著提高,且随着底物浓度的增加酶活性升高,抑制疫病菌生长的主要因素是诱导产生的CMC酶、木聚糖酶,而与B-1,3葡聚糖酶和蛋白酶关系不大。6.发酵条件优化结果表明,诱导ASD菌产生抑菌物质由高到低的碳源顺序为单糖、双糖和多糖,最佳碳源为葡萄糖；有机氮明显优于无机氮,最佳有机氮和无机氮分别为甘氨酸、硝酸铵；KCl、MgSO4·7H2O、FeSO4等盐类在低浓度下有利于抑菌物质产生结合正交试验确定生防菌ASD菌株产生抑菌物质的环境最佳发酵配方及条件是2%葡萄糖、0.1%甘氨酸、0.003%FeSO4、0.01%KCl、0.01%MgSO4·7H20,pH6,180rpm,30℃下,装液量30mL/100mL,培养5d。7.微生态区系分析表明,采集不同地块不同年限病株与健株的根际土壤细菌、放线菌及真菌数量变化规律不明显。同一地块健株根际土壤细菌与放线菌数量比病株多,而真菌数量比病株少；病株土壤较健株土壤的细菌/真菌、放线菌/真菌、细菌/放线菌值高。8.经对分离出的土壤优势微生物形态学观察、生理生化试验及16srDNA序列分析,鉴定出芽孢杆菌7种,占全部细菌种类43.75%；土壤放线菌17株。B33、B40、B22和B44菌株只鉴定到属,有待与进一步鉴定。9.ASD菌株对土壤微生态区系影响研究表明,施用生防菌后,健株与病株根际土壤中细菌和放线菌数量均有所减少,真菌数量增加。随着生防菌ASD菌株定殖时间增加,健株根际土壤细菌数量逐渐增加,病株根际土壤细菌数量基本不变,而健株和病株土壤放线菌数量变化不大,健株和病株土壤真菌数量逐渐下降。10.对土壤酶影响研究表明,施用生防菌ASD菌株后,健株与病株根际土壤脲酶活性、酸性磷酸酶活性、蔗糖酶活性及脱氢酶活性均有不同程度的提高,只有过氧化氢酶活性提高不显著；随着生防菌ASD菌病定殖时间增加,不同酶活性变化趋势基本一致,即增加后下降,但均高于对照；施用ASD菌株后影响各种土壤酶活性大小的顺序依次为脲酶、脱氢酶、蔗糖酶、酸性磷酸酶和过氧化氢酶,可以改良土壤环境。

全文目录

摘要  10-12
Abstract  12-15
前言  15-16
第一章辣椒疫病与微生态调控研究进展  16-35
  1 辣椒疫病研究进展  16-21
  2 生防菌研究进展  21-28
  3 微生态调控研究进展  28-35
第二章辣椒疫病菌遗传多样性研究  35-54
  1 材料与方法  35-39
  2 结果与分析  39-53
    2.1 辣椒疫病田间症状  39-40
    2.2 病原菌分离  40
    2.3 致病性测定  40-41
    2.4 致病菌形态学观察  41-42
    2.5 病菌基因组DNA提取  42
    2.6 病菌rDNA-ITS扩增结果  42-43
    2.7 病菌rDNA-ITS序列分析  43-47
    2.8 病菌致病力测定  47-49
    2.9 SRAP-PCR引物的筛选  49
    2.10 辣椒疫霉病菌SRAP引物扩增  49-51
    2.11 辣椒疫霉病菌SRAP聚类分析  51-53
  3 小结  53-54
第三章辣椒疫病生防菌株筛选、防控机理研究  54-72
  1 材料与方法  54-62
  2 结果与分析  62-71
    2.1 土壤微生物分离与生防菌初筛  62-63
    2.2 生防菌对辣椒疫病防治效果评价  63-64
    2.3 ASD菌株形态观察  64
    2.4 ASD菌株DNA提取及检测  64
    2.5 ASD菌株rDNA-ITS序列测定及分析  64-65
    2.6 ASD菌株土壤定殖能力评价  65-66
    2.7 ASD菌株抑菌物质酸碱稳定性测定  66
    2.8 ASD菌株抑菌物质溶解性确定  66-67
    2.9 ASD菌株抑菌物质热稳定性测定  67-68
    2.10 ASD菌株发酵液对辣椒疫霉病菌形态影响  68
    2.11 ASD菌株发酵液纤维素酶活性测定  68-69
    2.12 ASD菌株发酵液木聚糖酶活性测定  69-70
    2.13 ASD菌株发酵液蛋白酶活性测定  70
    2.14 ASD菌株发酵液β-1,3葡聚糖酶活测定  70-71
  3 小结  71-72
第四章生防菌ASD菌株发酵条件优化研究  72-82
  1 材料与方法  72-75
  2 结果与分析  75-81
    2.1 不同培养时间对ASD菌株抑菌活性影响  75
    2.2 不同碳源对ASD菌株产生抑菌物质影响  75-76
    2.3 不同氮源对ASD菌株产生抑菌物质影响  76
    2.4 不同盐类浓度对ASD菌株产生抑菌物质影响  76-77
    2.5 不同pH值对ASD菌株产生抑菌物质影响  77-78
    2.6 不同温度对ASD菌株产生抑菌物质影响  78
    2.7 不同转数对ASD菌株产生抑菌物质影响  78-79
    2.8 不同装液量对ASD菌株产生抑菌物质影响  79
    2.9 正交试验结果  79-81
  3 小结  81-82
第五章保护地辣椒生产土壤微生物优势种群分析  82-103
  1 材料与方法  82-89
  2 结果与分析  89-102
    2.1 不同种植年限土壤微生态区系分析  89
    2.2 不同种植年限土壤微生物组成分析  89-90
    2.3 土壤优势细菌鉴定  90-94
    2.4 土壤优势放线菌鉴定  94-99
    2.5 土壤优势真菌鉴定  99-102
  3 小结  102-103
第六章生防菌ASD菌株对土壤微生态调控机理研究  103-117
  1 材料与方法  103-110
  2 结果与分析  110-116
    2.1 生防菌ASD菌株对土壤微生态细菌区系影响分析  110
    2.2 生防菌ASD菌株对土壤微生态放线菌区系影响分析  110-111
    2.3 生防菌ASD菌株对土壤微生态真菌区系影响分析  111
    2.4 生防菌ASD菌株对土壤脲酶活性影响分析  111-112
    2.5 生防菌ASD菌株对土壤酸性磷酸酶活性影响分析  112-113
    2.6 生防菌ASD菌株对土壤蔗糖酶活性影响分析  113-114
    2.7 生防菌ASD菌株对脱氢酶活性影响分析  114-115
    2.8 生防菌ASD菌株对土壤过氧化氢酶活性影响分析  115-116
  3 小结  116-117
第七章结论与讨论  117-120
  1 结论  117-118
  2 讨论  118-120
参考文献  120-126
致谢  126-127
附图  127-145

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