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川芎提取物解除精异丙甲草胺对水稻药害的研究

作　者: 李静波
导　师: 柏连阳
学　校: 湖南农业大学
专　业: 农药学
关键词: 川芎安全剂 Z-藁本内酯精异丙甲草胺高速逆流色谱
分类号: S435.11
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

从植物中寻找具有生物活性的化合物,直接将其开发成为新农药,或者间接把这些活性物质当做先导化合物,进行结构修饰开发出生物活性更高的化合物,是目前农药研发的一条重要途径,也是新农药创制的研究热点。伞形科植物川芎(Ligusticum chuanxiong)根茎是重要的传统中药,能够活血化瘀,治疗心血管、脑血管疾病、头痛和月经失调等疾病。本实验室经过多年的研究证实川芎具有解除酰胺类除草剂对水稻药害的作用,本论文在前人的研究基础上采用CO2超临界流体萃取法(CO2-SFE)提取川芎解除精异丙甲草胺对水稻药害的有效成分,通过高速逆流色谱法(HSCCC)一步分离获得活性成分,对其进行了结构鉴定和活性测定,并初步研究其作用机理。为活性成分的开发应用提供了必要的实验基础。获得的主要研究成果如下：1川芎解除精异丙甲草胺对水稻药害的有效成分提取CO2-SFE提取川芎活性成分,优化CO2-SFE萃取条件,优化条件为：萃取温度70℃、萃取压力35MPa、萃取时间2.5h和提取率4.45%。以Z-藁本内酯和洋川芎内酯A为指标,对川芎提取物进行质量控制,提取物中洋川芎内酯A和Z-藁本内酯的含量为17.85%和40.58%。2川芎提取物室内和田间生物活性测定室内生物测定表明提取物明显缓解精异丙甲草胺对水稻药害。提取物在琼脂培养基中能够完全恢复除草剂对水稻株高的抑制,对根长的恢复接近对照水平；在土壤基质培养中对株高的恢复接近对照水平。提取物的田间试验表明60g/hm2和90g/hm2精异丙甲草胺对水稻有明显的抑制作用,影响水稻整个生育期。川芎提取物能够很好的缓解除草剂的伤害作用,对60g/hm2除草剂的伤害可以完全恢复到空白处理的水平；对90g/hm2除草剂的恢复作用下降；过量的提取物反而对水稻有伤害作用,影响对水稻的恢复作用；对照安全剂解草啶对水稻的解毒效果一般。测产结果证明240g/hm2提取物和60g/hm2除草剂组合处理的产量最高,空白处理因为受杂草的影响,产量减少。稗草防效调查结果表明2个除草剂用量对禾本科杂草防效很好,低剂量除草剂的防效接近90%,高剂量除草剂的防效95%左右,2个时间点内稗草防效稳定。提取物和解草啶对除草剂的防效没有显著的影响。3川芎提取物中生物活性成分的分离与鉴定提取物四个主要成分对应的目标峰1-4的K值在溶剂体系正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水[5：4：3：2(v/v)]中分别为0.18、0.50、2.01和3.40。经HSCCC分离获得四个主要成分,其中目标峰1和2经过HPLC或者GC-MS检测,纯度没有达到结构鉴定的要求,另外两个目标峰3和4经NMR鉴定确认为Z-藁本内酯和洋川芎内酯A,分子量分别为190和192。两者结构极为相似,只有C8和C9之间双键和单键之差,两者属于苯酞类化合物。4室内生物活性测定Z-藁本内酯明显缓解精异丙甲草胺对水稻药害。其在琼脂培养基中能够完全恢复除草剂对水稻株高的抑制,对根长的恢复接近对照水平；其在土壤基质培养中对株高的恢复接近对照水平。洋川芎内酯A在两种培养方式中对水稻的恢复作用一般。5活性成分Z-藁本内酯解除精异丙甲草胺对水稻药害的机理研究藁本内酯提高GST活性,增强植物对除草剂的解毒代谢能力,恢复除草剂对水稻的抑制作用。除草剂对水稻根和茎叶GST活性的影响与空白处理无明显差异,能够抑制水稻生长。Z-藁本内酯的解毒处理后,随着Z-藁本内酯浓度增大,根和茎叶的GST活性随之提高,水稻幼苗根和茎叶的恢复率也随之提高；当浓度为4mg/L,根和茎叶的GST活性分别是空白处理11倍和5倍左右,水稻幼苗的恢复率达到最大值；当浓度大于4mg/L,GST活性基本保持不变,此时对水稻幼苗恢复作用下降。经Real-time PCR分析,水稻OsGSTU2基因的mRNA在空白处理、除草剂处理和除草剂与Z-藁本内酯组合处理中呈现差异表达。经除草剂和Z-藁本内酯组合处理,水稻OsGSTU2基因的mRNA表达量大于除草剂处理和清水处理。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-13
第一章文献综述  13-30
  1 研究的目的和意义  13-14
  2 除草剂安全剂研究进展  14-23
    2.1 除草剂安全剂的类型  14-16
    2.2 除草剂安全剂的机理研究  16-23
  3 HSCCC和SFE的研究进展  23-27
    3.1 HSCCC的研究进展  23-26
    3.2 SFE的研究进展  26-27
  4 川芎的研究进展  27-29
    4.1 川芎的化学成分  27-28
    4.2 川芎有效成分在医药和农业方面的研究进展  28-29
  5 主要研究内容及技术路线  29-30
    5.1 主要研究的内容  29
    5.2 技术路线  29-30
第二章川芎活性成分提取与分离  30-40
  1 仪器、试验材料和试剂  30-31
    1.1 试验仪器  30-31
    1.2 试验材料  31
    1.3 主要试剂  31
  2 方法  31-33
    2.1 CO_2-SFE提取川芎活性成分  31
    2.2 提取物紫外分光光度计波谱扫描和HPLC分析  31
    2.3 提取物中活性成分的定量检测  31-32
    2.4 HSCCC分离川芎活性成分  32-33
  3 结果  33-37
    3.1 CO_2-SFE提取川芎活性成分的条件优化和定量检测  33-34
    3.2 两相溶剂体系的选择和其它条件的优化  34-37
  4 小结与讨论  37-40
    4.1 CO_2-SFE提取川芎活性成分  37-38
    4.2 HSCCC分离川芎活性成分  38-40
第三章川芎活性成分的结构鉴定和波谱分析  40-48
  1 仪器、试验材料和试剂  40-41
    1.1 试验仪器  40-41
    1.2 试验材料  41
    1.3 试剂  41
  2 方法  41-42
    2.1 化合物纯度的检查(HPLC检查)  41
    2.2 紫外光谱分析  41
    2.3 LC-MS、GC-MS和NMR测定  41-42
  3 结果  42-47
    3.1 目标峰1-4纯度HPLC初步鉴定  42-43
    3.2 目标峰1-4光谱鉴定结果  43-47
  4 小结与讨论  47-48
第四章川芎提取物和分离组分的活性研究  48-63
  1 川芎提取物和分离组分室内生物活性测定  48-54
    1.1 仪器、试验材料和试剂  48-49
    1.2 方法  49-50
    1.3 结果  50-54
  2 提取物的大田生物活性测定  54-61
    2.1 试验地点、试验材料和试剂  54
    2.2 方法  54-55
    2.3 结果  55-61
  3 小结与讨论  61-63
第五章 Z-藁本内酯解除精异丙甲草胺对水稻药害的机理研究  63-69
  1 仪器、试验材料和试剂  63-64
    1.1 试验仪器  63-64
    1.2 试验材料  64
    1.3 试验试剂  64
  2 方法  64-66
    2.1 水稻培养和药剂处理  64
    2.2 酶液提取和纯化  64
    2.3 紫外分光光度计测GST活性  64
    2.4 蛋白质测定  64
    2.5 RNA提取  64-65
    2.6 Real-time PCR  65-66
  3 结果  66-67
    3.1 Z-藁本内酯对GST活性的影响  66
    3.2 Real-time PCR  66-67
  4 小结与讨论  67-69
    4.1 除草剂和Z-藁本内酯对水稻GST活性影响  67
    4.2 除草剂和Z-藁本内酯对水稻OsGSTU2基因的mRNA的影响  67-69
第六章结论、创新点与展望  69-72
  1 研究结论  69-71
    1.1 川芎缓解精异丙甲草胺对水稻药害的活性成分提取和提取物中活性成分的定量检测  69
    1.2 川芎缓解除草剂精异丙甲草胺对水稻药害的活性成分分离  69
    1.3 活性成分结构鉴定  69
    1.4 川芎提取物和分离组分的室内解毒效果  69-70
    1.5 川芎提取物的田间解毒效果  70
    1.6 川芎提取物对精异丙甲草胺在水稻田的除草活性的影响  70
    1.7 Z-藁本内酯对水稻GST活性和OsGSTU2表达的影响  70-71
  2 主要创新点  71
  3 下一步工作计划  71-72
参考文献  72-85
缩略词表  85-87
附图和附表  87-101
致谢  101-102
作者简历  102-103

川芎提取物解除精异丙甲草胺对水稻药害的研究

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