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拟南芥类脂转移蛋白AtDHyPRP1的亚细胞定位及其对灰霉菌和丁香假单胞菌的抗性功能

作　者: 张晨
导　师: 徐子勤
学　校: 西北大学
专　业: 细胞生物学
关键词: AtDHyPRP1 过表达 RNAi 丁香假单胞菌 蒜薹灰霉菌 拟南芥 秦烟95 DAB染色 台酚兰染色 亚细胞定位 SAR
分类号: S432.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


拟南芥AT4G22470基因编码的蛋白质由信号肽、两个富含脯氨酸结构域(Proline-Rich Domain, PRD)和两个8CM(Eight Cysteine Motif)构成。由于对该基因的功能尚未见报道,本工作将其命名为AtDHyPRP1(DOUBLE HYBRID PROLINE-RICH PROTEIN1)。采用DNAStar MegAlign中的CLUSTAL W算法比对氨基酸序列,发现AtDHyPRP1的8CM与植物LTP在8个半胱氨酸的分布位置上十分相似。AtDHyPRP1的理论等电点和分子量分别为8.68和38789.6Da,其分子式为C1772H2800N4440487S21,原子总数为5524。AtDHyPRP1蛋白的N端1-23位氨基酸具有典型的信号肽特征,可能性达到0.999。该蛋白无跨膜区域,其疏水性平均值为1.103,表明该蛋白为疏水性蛋白。二级结构预测结果显示,AtDHyPRP1蛋白N末端存在螺旋、无规则卷曲和折叠等多种结构形式。基因芯片分析数据表明,丁香假单胞菌侵染后AtDHyPRP1基因可以被强烈诱导。为了研究AtDHyPRP1的功能,本工作采用PCR方法扩增了它的编码序列,并连接到CaMV35S启动子下游,构建产生植物双元表达载体pRI101-AN-AtDHyPRP1,然后通过农杆菌介导的叶盘转化方法得到了转基因烟草植株。PCR、Southern印迹、RT-PCR和Northern印迹分析结果证实AtDHyPRP1基因已经整合进烟草基因组并能够有效表达。用蒜薹灰霉菌孢子侵染切下的野生型和转基因烟草叶片,发现AtDHyPRP1基因能够明显增加烟草对灰霉菌的抗性,转AtDHyPRP1烟草叶片的被侵染部位有大量H202积累。台酚兰染色结果表明,与转AtDHyPRP1烟草相比,野生型植株叶片上有大量死亡的细胞,说明该基因在抵抗生物胁迫过程中具有重要作用。同时将AtDHyPRP1基因开放阅读框序列连接到pCAMBIA1302中的绿色荧光蛋白基因之前,构建产生融合表达载体,通过农杆菌介导的浸花法得到了3株35S::AtDHyPRP1-GFP转基因拟南芥植株。激光共聚焦显微观察结果显示AtDHyPRP1蛋白定位在细胞表面,这一结果与生物信息学和抗性分析结果一致,说明该蛋白在合成后被分泌到植物细胞的表面来执行特殊的功能,与植物的抗病防御机制有关。为了进一步的研究AtDHyPRP1在抗病反应中的功能,本工作通过农杆菌介导的浸花法得到了4株AtDHyPRPl过表达(OX)和6株RNA干扰(RNAi)拟南芥植株,并利用AtDHyPRPl基因上下游引物以及Bar基因上下游引物通过PCR从T-DNA(?)插入系筛选得到5株纯合的敲除突变体(KO)。RT-PCR分析结果表明,AtDHyPRP1在过表达植株中明显上调,在RNA干扰株系中表达量下调,在T-DNA敲除纯合突变体中不能表达。在Ws野生型植株(Wt)中,AtDHyPRP1表达受有毒丁香假单胞菌Pst DC3000(Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000)和无毒丁香假单胞菌Pst avrRpm1诱导,并且在Pst DC3000侵染24h和Pst avrRpm1侵染8h后达到峰值,随后略有降低,在48h后又表现增加。接种蒜薹灰霉菌(Botrytis cinerea)、有毒丁香假单胞菌Pst DC30004天以后,不同材料被灰霉菌侵染的程度依次为OXSAR分析中,先用无毒Pst avrRpm1(AV)或MgSO4(MV)接种叶片,再用有毒Pst DC3000接种其它叶片,4天后发现,相对于MV处理,过表达、野生型和RNAi植株经AV处理后叶片的萎黄和坏死现象明显减轻,过表达、野生型植株的大部分叶片仍然保持绿色,而T-DNA敲除纯合突变体株系经AV和MV处理后并无明显差别,大部分叶片都已萎黄。统计学分析结果显示,AV处理后T-DNA敲除纯合突变体的细菌生长量明显高于野生型Ws,而MV处理后T-DNA敲除纯合突变体与野生型Ws的细菌生长量并无明显差别。以上结果显示AtDHyPRPl基因在拟南芥抵抗病原菌侵染过程中具有重要功能。

全文目录


摘要  3-5
Abstract  5-13
第一章 引言  13-26
  1.1 植物脂质转移蛋白(LTP)研究进展  13-16
    1.1.1 LTP的理化性质  13
    1.1.2 植物LTP在细胞中的定位  13-14
    1.1.3 LTP家族的生物学功能  14-15
      1.1.3.1 LTP与信号转导  14
      1.1.3.2 LTP在角质、胚胎形成方面的功能  14
      1.1.3.3 LTP的抗性和防御功能  14-15
    1.1.4 AtDHyPRP1基因的研究进展  15-16
  1.2 绿色荧光蛋白(GFP)  16-18
    1.2.1 GFP的理化性质  16-17
    1.2.2 GFP在生物学中的应用  17-18
      1.2.2.1 GFP是最重要的报告基因  17
      1.2.2.2 GFP可作为蛋白质研究的标签  17-18
  1.3 植物抗病机制  18-24
    1.3.1 超敏反应(Hypersensitive Response,HR)  18-19
    1.3.2 系统获得性抗性(systemic acquired resistance,SAR)  19-20
    1.3.3 拟南芥与丁香假单胞菌之间的互作关系  20-24
      1.3.3.1 丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)  20
      1.3.3.2 拟南芥与丁香假单胞菌互作体系  20
      1.3.3.3 拟南芥与丁香假单胞菌互作体系中的R基因和Avr基因  20-22
        1.3.3.3.1 拟南芥与丁香假单胞菌互作体系中的R基因  20-21
        1.3.3.3.2 拟南芥与丁香假单胞菌互作体系中的Avr基因  21-22
      1.3.3.4 拟南芥与丁香假单胞菌体系的互作模型  22-24
  1.4 本工作的研究目的  24
  1.5 研究内容  24-26
第二章 AtDHyPRP1蛋白的计算机分析  26-32
  2.1 方法  26
    2.1.1 生物信息学软件  26
    2.1.2 方法  26
  2.2 结果  26-30
    2.2.1 AtDHyPRP1蛋白的结构特征  26-27
    2.2.2 AtDHyPRP1蛋白的理化性质  27-29
    2.2.3 AtDHyPRP1蛋白的结构分析  29-30
    2.2.4 AtDHyPRP1与植物LTP的氨基酸序列比对  30
    2.2.5 AtDHyPRP1基因的芯片数据分析  30
  2.3 讨论  30-32
第三章 AtDHyPRP1敲除突变体、过表达、RNA干扰与35S::AtDHyPRP1-GFP转基因株系的筛选与鉴定  32-60
  3.1 材料与方法  32-46
    3.1.1 材料与试剂  32
    3.1.2 AtDHyPRP1过表达株系的筛选  32-38
      3.1.2.1 AtDHyPRP1基因的克隆  32-37
      3.1.2.2 AtDHyPRP1基因过表达载体的构建  37-38
    3.1.3 35S::AtDHy-PRP1-GFP融合表达载体的构建  38-40
    3.1.4 AtDHyPRP1 RNA干扰载体的构建  40-42
      3.1.4.1 反向片段的连接  40-41
      3.1.4.2 正向片段的连接  41-42
    3.1.5 T-DNA敲除纯合突变体的筛选  42
      3.1.5.1 BASTA筛选  42
      3.1.5.2 PCR筛选  42
    3.1.6 AtDHyPRP1过表达、RNAi与35S::AtDHyPRP1-GFP转基因拟南芥植株的筛选与鉴定  42-46
      3.1.6.1 农杆菌LBA4404感受态细胞的制备  42-43
      3.1.6.2 农杆菌感受态细胞的冻融法转化  43
      3.1.6.3 农杆菌介导的拟南芥转化  43-45
      3.1.6.4 转基因拟南芥植株的筛选与鉴定  45-46
  3.2 结果  46-58
    3.2.1 AtDHyPRP1过表达拟南芥转基因株系的筛选  46-50
      3.2.1.1 AtDHyPRP1基因的分离与过表达载体pRI101-AN-AtDHyPRP1的构建  46-47
      3.2.1.2 通过冻融法将RI101-AN-AtDHyPRP1过表达载体转化至农杆菌LBA4404  47-48
      3.2.1.3 AtDHyPRP1过表达转基因株系的筛选与鉴定  48-50
    3.2.2 35S::AtDHyPRP1-GFP拟南芥转基因株系的筛选  50-54
      3.2.2.1 融合表达载体pCAMBIA1302-AtDHyPRP1-GFP的构建  50-51
      3.2.2.2 通过冻融法将融合表达载体pCAMBIA1302-AtDHyPRP1-GFP转化至农杆菌LBA4404  51-52
      3.2.2.3 35S::AtDHyPRP1-GFP拟南芥转基因株系的筛选与鉴定  52-54
    3.2.3 AtDHyPRP1 RNAi拟南芥株系的筛选  54-57
      3.2.3.1 RNA干扰载体RNAi-AtDHyPRP1的构建  54-55
      3.2.3.2 通过冻融法将RNA干扰载体RNAi-AtDHyPRP1转化至农杆菌LBA4404  55
      3.2.33 AtDHyPRP1 RNAi拟南芥株系的筛选与鉴定  55-57
    3.2.4 T-DNA敲除纯合突变体株系的筛选  57-58
      3.2.4.1 Basta选择  57
      3.2.4.2 AtDHyPRP1在纯合突变体中的表达分析  57-58
  3.3 讨论  58-60
第四章 AtDHyPRP1的亚细胞定位及其对灰霉菌的抗性  60-76
  4.1 材料与方法  60-67
    4.1.1 材料与试剂  60
    4.1.2 转AtDHyPRP1基因烟草植株的再生和分子鉴定  60-66
      4.1.2.1 烟草的叶圆盘法转化  60
      4.1.2.2 转基因烟草的分子鉴定  60-66
        4.1.2.2.1 转基因烟草的PCR检测  61
        4.1.2.2.2 转基因烟草的RT-PCR检测  61-62
        4.1.2.2.3 转基因烟草的Southern印迹分析  62-65
        4.1.2.2.4 转基因烟草的Northern印迹分析  65-66
    4.1.3 蒜薹灰霉菌侵染分析  66-67
    4.1.4 AtDHyPRP1蛋白的亚细胞定位  67
  4.2 结果  67-75
    4.2.1 转AtDHyPRP1基因烟草的再生  67-68
    4.2.2 转AtDHyPRP1基因烟草的PCR及RT-PCR检测  68-69
      4.2.2.1 转AtDHyPRP1基因烟草的PCR检测  68
      4.2.2.2 转AtDHyPRP1基因烟草的RT-PCR检测  68-69
    4.2.3 转AtDHyPRP1基因烟草的Southern blotting分析  69
    4.2.4 转AtDHyPRP1基因烟草的Northern blotting分析  69-70
    4.2.5 转AtDHyPRP1基因烟草对蒜薹灰霉菌的抗性分析  70-71
    4.2.6 台酚蓝染色  71
    4.2.7 DAB染色  71-72
    4.2.8 AtDHyPRP1蛋白的亚细胞定位  72-75
      4.2.8.1 转AtDHyPRP1-GFP拟南芥根细胞的GFP荧光观察  72-73
      4.2.8.2 转AtDHyPRP1-GFP拟南芥叶片细胞的GFP荧光观察  73-74
      4.2.8.3 转AtDHyPRP1-GFP拟南芥茎细胞的GFP荧光观察  74
      4.2.8.4 转AtDHyPRP1-GFP拟南芥根细胞中GFP荧光强度的变化  74-75
  4.3 讨论  75-76
第五章 AtDHyPRP1对灰霉菌和丁香假单胞菌的抗性  76-86
  5.1 材料与方法  76-78
    5.1.1 材料  76
    5.1.2 Pst DC3000和Pst avrRpt2侵染后AtDHyPRP1基因的表达分析  76
      5.1.2.1 Pst DC3000和Pst avrRpt2侵染  76
      5.1.2.2 RT-PCR分析  76
    5.1.3 AtDHyPRP1过表达、RNA干扰、纯合突变体和Ws野生型拟南芥对蒜薹灰霉菌的应答特征  76
      5.1.3.1 蒜薹灰霉菌的培养  76
      5.1.3.2 侵染后的表型观察  76
    5.1.4 AtDHyPRP1过表达、RNA干扰、纯合突变体和Ws野生型拟南芥对有毒Pst DC3000侵染的应答特征  76-77
      5.1.4.1 丁香假单胞菌的培养  77
      5.1.4.2 侵染后的表型观察  77
      5.1.4.3 细菌生长量分析  77
    5.1.5 系统性获得抗性(SAR)分析  77-78
      5.1.5.1 侵染后的表型观察  77-78
      5.1.5.2 细菌生长量分析  78
    5.1.6 Pst DC3000侵染35S::AtDHyPRP1-GFP转基因拟南芥植株后AtDHyPRP1亚细胞定位的变化  78
      5.1.6.1 Pst DC3000侵染35S::AtDHyPRP1-GFP转基因拟南芥植株后根细胞中AtDHyPRP1定位的变化  78
      5.1.6.2 Pst DC3000侵染35S::AtDHyPRP1-GFP转基因拟南芥植株后叶片细胞中AtDHyPRP1定位的变化  78
  5.2 结果  78-85
    5.2.1 Pst DC3000和Pst avrRpt2侵染后AtDHyPRP1基因的表达特征  78-79
    5.2.2 AtDHyPRP1过表达、RNA干扰、纯合突变体和Ws野生型拟南芥对蒜薹灰霉菌的应答特征  79
    5.2.3 AtDHyPRP1过表达、RNA干扰、纯合突变体和Ws野生型拟南芥对Pst DC3000的应答特征  79-81
    5.2.4 系统性获得抗性(SAR)分析  81-83
    5.2.5 Pst DC3000侵染35S::AtDHyPRP1-GFP转基因拟南芥植株后AtDHyPRP1亚细胞定位的变化  83-85
  5.3 讨论  85-86
结论  86-88
  1 研究结论  86-87
  2 本研究的特色与创新  87-88
参考文献  88-99
附录  99-101
攻读硕士学位期间取得的学术成果  101-102
致谢  102

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 植物病害及其防治 > 植物免疫学
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