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人舌鳞癌细胞株Tca8113中侧群细胞的分离及体外增殖成瘤能力的初步分析

作　者: 伍明毅
导　师: 季平
学　校: 重庆医科大学
专　业: 口腔医学
关键词: 人舌鳞癌 侧群细胞 流式细胞分选 细胞增殖能力 致瘤性
分类号: R739.86
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


本文检测和分选人舌鳞癌细胞株Tca8113中的侧群细胞(side population cells ,SP cells),并对其体外增殖、致瘤能力进行初步分析。以考察人舌鳞癌细胞株Tca8113中的侧群细胞是否具有类肿瘤干细胞的生物学特性,为舌鳞癌中肿瘤干细胞的有效富集策略提供新的方案。1. Tca88813细胞株Hoechest33342染色及流式细胞技术SP细胞分选方法:将人舌鳞癌细胞株Tca8113培养在含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基完全培养液中,置于5%CO2,3 7℃饱和温度的培养箱中培养,每日换液当细胞生长到铺满瓶底80%时加完全培养液按1:2或1:3传代培养。取数瓶已培养的细胞,细胞总量为108数量级。①以0.01%P B S冲洗,适量0.125%胰酶消化,中止消化后,HBSS(8g/L Nacl, 0.4g/L Kcl, 1g/L葡萄糖, 60mg/L KH2PO4, 47.5 mg/L Na2HPO4,调pH至7.2.)洗涤,重悬,离心,弃上清。②Hoechest33342染色,将1ml/ml的Hoechest33342及维拉帕米加入单细胞悬液中,使其Hoechest33342终浓度为5μg/ml。3 7℃恒温水浴90分钟,并时常晃动充分混匀;③90分钟后, 4℃低温离心500r/min,10min;收集沉淀,在4℃用含2 /ml碘化丙啶(PI)的HBSS平衡盐溶液平衡沉淀即为染色好的细胞(PI目的为标记死细胞);④流式细胞仪检测分选,激发光波长为350nm,采集波长为450nm和675nm(分选前标本保持在4℃),上机分选,发光偏弱的就是SP细胞。结果:Hoechest33342染色后,对照组加入维拉帕米拮抗,通过流式细胞仪分选到Tca8113中的SP细胞约占总细胞数量0.8%。实验结果表明,人舌鳞癌细胞株Tca8113中含有微量的SP细胞。2.甲基偶氮唑蓝( MTT)法检测SP细胞体外增殖能力方法:将分选的SP细胞,MP细胞以及未分选的细胞种植于9 6孔板内,每孔加用0.2ml含20ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、20ng /ml表皮生长因子(EGF)、5μg/ml胰岛素的的无血清培养液,2000细胞/孔(设空白组用于调零)。置于5%CO2,37℃饱和温度的培养箱中培养,每2 d换液1次,在第1、3、5、7d用MTT比色法测定细胞的增殖状态,以490nm吸光度(A)值量化活细胞数,每组所得数据取均值,绘制细胞生长曲线,比较3组细胞的增殖速度。结果:分选出的SP细胞,立即在无血清培养基中培养,细胞呈单细胞、球形、悬浮生长。随着培养时间延长,细胞呈团块状生长体积逐渐增大,细胞数量增多,培养5d后,细胞呈葡萄串状生长,肿瘤球形成。将悬浮细胞离心,用含10%小牛血清的RPMI1640培养,24h后细胞贴壁生长。而根据MTT比色法于测定吸光度(A)值显示,在无血清培养基中,SP细胞与MP细胞以及未分选细胞相比,有较强的体外扩增能力,且1-3d及5-7d时更为显著。实验结果证明了Tca88813细胞株中的SP细胞具有类肿瘤干细胞的体外扩增能力。3.SP细胞及未分选细胞裸鼠皮下接种动物模型建立方法:选取24只8周龄雌性NOD/SCID小鼠作为实验对象,随机分为两组组(即SP及未分选组)每组12只,各组内随机分成A、B、C、D4个小组,分别给予背部皮下细胞接种,数量级分别为103 104 105 106/ml,注射后于无菌饲养间内饲养,观察裸鼠成瘤情况。结果:103数量级的SP及未分选细胞接种的裸鼠,均未成瘤。接种13d后, 105、106数量级的SP接种裸鼠背部出现瘤体,14d后104数量级SP细胞及106数量级未分选细胞接种的裸鼠背部出现瘤体。28d后,瘤体直径均达到1-1.3cm。实验结果表明,Tca88813细胞株中的SP细胞具有类肿瘤干细胞的高成瘤能力。研究结果表明,舌癌中的SP细胞可作为舌癌干细胞富集策略之一。人舌鳞癌中存在类肿瘤干细胞,并具有自我更新及高致瘤性。

全文目录


英汉缩略语名词对照  5-6
中文摘要  6-9
英文摘要  9-13
论文正文：人舌鳞癌细胞株 Tca8113 中侧群细胞的分离及体外增殖、成瘤能力的初步分析  13-29
  前言  13-15
  第一部分 Tca88813 细胞株Hoechest33342 染色及流式细胞技术SP 细胞分选  15-19
    前言  15
    1 材料与方法  15-16
    2 结果  16-17
    3 讨论  17-19
  第二部分 甲基偶氮唑蓝(MTT) 法检测SP 细胞体外增殖能力  19-24
    前言  19
    1 材料与方法  19-20
    2 结果  20-22
    3 讨论  22-24
  第三部分 SP 细胞及未分选细胞裸鼠皮下接种动物模型建立  24-28
    前言  24
    1 材料与方法  24-25
    2 结果  25-26
    3 讨论  26-28
  全文总结  28-29
参考文献  29-31
附图  31-41
致谢  41-42
攻读硕士期间发表的学术论文目录  42

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 口腔、颌面部肿瘤 > 舌肿瘤、舌下肿瘤
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