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MAPK在斑马鱼卵母细胞第一次减数分裂恢复过程中的生理功能
作 者: 李国鹏
导 师: 魏华
学 校: 上海海洋大学
专 业: 水生生物学
关键词: 丝裂原活化蛋白激酶(MAPK) 斑马鱼 卵母细胞 石蜡切片 免疫组化
分类号: Q343
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
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内容摘要
MAPK是一类广泛存在于真核细胞中的Ser/Thr蛋白激酶,参与调节各种生理活动。该酶家族分为三类,胞外信号调节酶(the extracellular signal regulated kinase ,ERK), c-jun氨基末端激酶(the c-Jun NH terminal kinase, JNK)和p38 MAPK。其中ERK又包含多种蛋白家族成员,研究最多的是ERK1和ERK2,通常MAPK就是指ERK1和ERK2。近期研究表明,MAPK信号通路在卵母细胞减数分裂过程中发挥重要作用。本文首先以不同激素对斑马鱼卵母细胞进行成熟诱导培养,研究激素对卵母细胞成熟的促进作用,选择合适卵母细胞体外培养体系;其次用17α,20β双羟孕酮(17α,20β-DHP)和FSH诱发以GVBD(germinal vesicle breakdown,GVBD)为标志的卵母细胞成熟,利用Western Blot检测MAPK(p-MAPK)在斑马鱼卵母细胞发生GVBD中的表达量,研究MAPK对斑马鱼卵母细胞的成熟调节作用;最后在改进石蜡切片的基础上,通过免疫组化技术,检测MAPK在卵母细胞GVBD产生时的时空分布和位移,并探讨了这个时空分布的生理意义。第一部分,建立了斑马鱼卵母细胞体外培养体系。比较了17α,20β-DHP和FSH体外诱发斑马鱼卵母细胞成熟作用。结果表明:①1U/mL FSH对斑马鱼卵母细胞GVBD促进效果最明显,与对照组相比卵母细胞GVBD率在FSH作用2 h、4 h、6 h、8 h后分别提高了11.98%、16.67%、6.31%、14.25%;添加10μg/mLU0126后,其GVBD率在2h、4h、6h、8h分别降低了26.11%、29.2%、23.12%、28.73%。②5 ng/mL l7α,20β-DHP的对斑马鱼卵母细胞GVBD促进效果最明显,与对照组相比卵母细胞GVBD率在l7α,20β-DHP作用2 h、4 h、6 h、8 h后分别提高了17.84%、44.67%、27.62%、23.03%;添加10μg/mLU0126后,其GVBD率在2h、4h、6h、8h分别降低了15.19%、46.82%、32.38%、27.4%。结果表明,FSH和l7α,20β-DHP对卵母细胞都有明显的的促进作用,其中l7α,20β-DHP促进作用显著好于FSH。第二部分,MAPK在斑马鱼卵母细胞第一次减数分裂恢复中的作用。在第一部分实验的基础上,用5 ng/mL l7α,20β-DHP诱导卵母细胞成熟,通过Western Bolt技术检测MAPK的表达。结果表明:在GVBD之前,MAPK被激活,MAPK活性越大,GVBD%越高。对照组中4h的时候才可以检测到MAPK活性,而且从4h-8h之间MAPK活性变化不大,GVBD%增长缓慢。实验组中卵母细胞在培养2 h后可以检测到激活的MAPK (pMAPK),随着时间推移pMAPK表达逐渐增多,6 h时pMAPK表达量达到最大。随着MAPK激活,卵母细胞发生GVBD,完成第一次减数分裂。最后添加10μg/mL U0126,抑制MAPK表达后,卵母细胞GVBD率明显降低。结果显示MAPK在卵母细胞的第一次减数分裂恢复中有重要促进作用。第三部分,斑马鱼卵母细胞GVBD过程中,MAPK时空分布。首先对卵母细胞石蜡切片制作过程技术了优化。对脱水、透明环节的时间进行了摸索、改进。制作的卵巢组织石蜡切片不易碎,镜下观察组织结构清晰,能清楚地观察到斑马鱼卵巢的I期、II期、III期、IV期、V卵母细胞,卵巢中的卵黄颗粒等细胞卵泡结构,能够满足切片要求和后续实验要求。然后通过免疫组化技术检测了在不同时期激活的MAPK在卵母细胞中的分布,结果表明:I期MAPK没有被激活;在II期时,活化的MAPK开始在细胞质中表达;在III、IV的时候,活化的MAPK表达量增多;卵母细胞在V期时已经发生GVBD,此时在细胞质和核区均可观察到激活的MAPK。实验结果表明FSH激活l7α,20β-DHP的表达,进而磷酸化MAPK,使细胞质中的MAPK激活,然后活性MAPK从细胞质向细胞核转移,从而其他蛋白的活性,促进斑马鱼卵母细胞发生GVBD和调节其他一些生理过程。所以MAPK在其第一次减数分裂过程中起到重要的作用。
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全文目录
摘要 3-5 ABSTRACT 5-12 第一章 文献综述 12-23 1.1 卵母细胞发育周期 12 1.2 卵泡的发育 12-13 1.2.1 卵泡的发育过程 12-13 1.2.2 卵泡细胞在卵母细胞发生中的作用 13 1.3 卵母细胞成熟 13-15 1.3.1 细胞核成熟 13-14 1.3.2 细胞质成熟 14-15 1.4 MAPK 15-18 1.4.1 MAPK 在成熟分裂起始阶段的多用 16-17 1.4.2 MAPK 在卵母细胞GVBD 后继事件中的作用 17 1.4.3 MAPK 在MII 期停滞中的作用 17-18 1.5 卵母细胞成熟过程中的其他调控因子 18-23 1.5.1 MPF 18-19 1.5.2 Mos 19 1.5.3 促性腺激素 19-20 1.5.4 cAMP/PKA 20-21 1.5.5 PKC 21 1.5.6 细胞生长因子 21-22 1.5.7 Ca2+ 22-23 第二章 17α,20β-DHP 和FSH 对斑马鱼卵母细胞的成熟诱导 23-34 2.1 实验材料 24-26 2.1.1 实验对象 24 2.1.2 仪器与药品 24 2.1.3 试剂配制 24-26 2.2 实验方法与数据处理 26-27 2.2.1 离体斑马鱼卵母细胞的获取 26 2.2.2 离体斑马鱼卵母细胞的体外培养 26-27 2.2.3 数据处理 27 2.3 结果 27-31 2.3.1 FSH 对卵母细胞GVBD 的影响 27-29 2.3.2 17α,20β-DHP 对斑马鱼卵母细胞GVBD 的影响 29-31 2.4 讨论 31-34 第三章 MAPK 在斑马鱼卵母细胞第一次减数分裂恢复中的作用 34-49 3.1 实验材料 36-41 3.1.1 实验对象 36 3.1.2 仪器与药品 36 3.1.3 试剂配制 36-41 3.2 实验方法 41-44 3.2.1 离体斑马鱼卵母细胞的获取 41 3.2.2 离体斑马鱼卵母细胞的体外培养 41-42 3.2.3 获取样品 42 3.2.4 样品前处理 42 3.2.5 SDS-PAGE 电泳 42 3.2.6 电泳、转膜 42-43 3.2.7 封闭 43 3.2.8 抗体孵育 43-44 3.2.9 荧光、拍照、显影和定影 44 3.2.10 结果分析 44 3.3 结果 44-47 3.3.1 17α,20β-DHP 的促进作用 44-45 3.3.2 U0126 对MAPK 的抑制作用以及GVBD 的影响 45-47 3.4 讨论 47-49 第四章 MAPK 在斑马鱼第一次减数分裂恢复中的定位 49-64 4.1 实验材料 50-53 4.1.1 实验对象 50-51 4.1.2 仪器与药品 51 4.1.3 试剂配制 51-53 4.2 实验方法 53-56 4.2.1 离体斑马鱼卵母细胞的获取 53 4.2.2 石蜡切片 53-54 4.2.3 染色步骤 54-56 4.2.4 免疫组化 56 4.3 斑马鱼卵母细胞分期标准 56-57 4.4 结果 57-60 4.4.1 石蜡切片 57-58 4.4.2 MAPK 在卵母细胞中的定位 58-60 4.5 讨论 60-64 4.5.1 石蜡切片 60-62 4.5.2 MAPK 在卵母细胞中的定位 62-64 小结 64-65 参考文献 65-75 致谢 75
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中图分类: > 生物科学 > 遗传学 > 遗传学分支学科 > 细胞遗传学
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