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虾塘养殖水中氮素迁移酶基因的多样性分析及异养氨氧化细菌的筛选

作　者: 李敬源
导　师: 林炜铁
学　校: 华南理工大学
专　业: 微生物学
关键词: PCR-DGGE 克隆文库 系统发育树 异养氨氧化细菌
分类号: X703
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


氨氧化作用、亚硝酸盐氧化作用和反硝化作用是氮循环的三个关键过程,其中amoA基因、nxrA基因和nirS基因是这三个过程关键酶的编码基因。对虾养殖塘水体是一个复杂的生物硝化系统,分析虾塘养殖水体中参与氮循环关键过程的菌群多样性,可以为指导实际对虾养殖水体中的NH4+和NO2-的微生物降解、水体氮素污染控制以及虾塘养殖氮素循环的有效管理提供科学依据。本文使用RCR-DGGE技术(Polymerase Chain Reaction-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)从8个不同地点的虾塘水样中确定了代表性水样,并以此典型水样进行研究,构建了氨单加氧酶基因(amoA)、亚硝酸盐氧化还原酶基因(nxrA)、亚硝酸盐还原酶基因(nirS)的克隆文库。利用限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP)技术将克隆文库进行酶切及序列多态性分析,并构建了系统发育树。最后从典型虾塘养殖水样中筛选出异养氨氧化细菌并对其进行化学反应检测、菌株形态观察、菌株的16SrRNA基因的鉴定以及其体内氨单加氧酶基因(amoA)的PCR扩增验证。所得结论如下：a.中山市港口镇的虾塘养殖水样可确定为珠三角地区8个采样点中的典型水样。b. amoA基因克隆文库中所有序列都属于变形杆菌门β亚纲((3-Proteobacteria),分别为亚硝化单细胞菌属(Nitrosomonas)(81%)和亚硝化螺旋菌属(Nitrosospira)(19%)两个属。其中亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)是典型虾塘养殖环境主要的氨氧化作用推动者。c. nxrA基因克隆文库检测到a-Proteobacteria和8-Proteobacteria两个亚纲,其中硝化杆菌属(Nitrobacter)是优势菌群,占整个文库的92%,仅有一个类群属于δ亚纲的脱硫杆菌科(Desulfobacteraceae)(8%)。硝化杆菌属(Nitrobacter)是典型虾塘养殖环境中主要的亚硝酸盐氧化作用推动者。d. nirS基因文库群落结构相对于amoA和nxrA基因文库较复杂,分别检测到α-Proteobacteria、β-Proteobacteria和Actinobacteria三个亚纲,其中25%的类群为固氮弧菌属(Azoarcus),25%的类群为(Polymorphum),20%的类群为需氧去氮菌属(Thauera),10%的类群为(Sophophora),10%的的类群为链霉菌属(Streptomyces),5%的类群为(Brachymonas),5%的类群为(Ruegeria)。e.筛选到AOBa和AOBb两株异养氨氧化细菌,分别为红球菌属细菌(Rhodococcussp.)和不动杆菌属细菌(Acinetobacter sp.)。

全文目录


摘要  5-7
Abstract  7-11
第一章 绪论  11-21
  1.1 对虾养殖现状及存在的病害、污染问题  11-12
  1.2 养殖水体污染的控制以及虾养殖生态系的研究进展  12-14
  1.3 环境微生物分子生态学的主要研究方法及氮循环功能酶基因的研究现状  14-19
    1.3.1 PCR-DGGE指纹图谱技术在菌群多样性分析上的应用  14-15
    1.3.2 基因克隆文库法分析菌群多样性  15-17
    1.3.3 基于核酸分子杂交技术的微生物分子生态研究  17-18
    1.3.4 氮循环功能基因研究现状  18-19
  1.4 本研究的目的与内容  19-21
    1.4.1 本研究的目的  19
    1.4.2 本研究的内容  19-21
第二章 珠三角地区典型虾塘养殖水样的确立  21-35
  2.1 材料和方法  21-29
    2.1.1 样品采集与预处理  21-22
    2.1.2 各水样基因组的提取与纯化  22-23
    2.1.3 各水样16S rRNA基因的PCR扩增  23
    2.1.4 DGGE与DGGE图谱分析  23-29
  2.2 结果与讨论  29-33
    2.2.1 各水样总DNA的提取结果  29
    2.2.2 各水样16SrDNA PCR产物扩增结果  29-30
    2.2.3 各水样16SrDNA PCR产物DGGE电泳图  30-31
    2.2.4 DGGE图谱分析  31-33
  2.3 本章小结  33-35
第三章 amoA、nxrA、nirS功能基因文库的构建及群落结构分析  35-56
  3.1 引言  35-38
    3.1.1 氮循环及其关键过程简介  35-36
    3.1.2 参与氮循环关键过程的微生物研究进展  36-37
    3.1.3 参与氮循环重要过程的关键酶简介  37
    3.1.4 本章研究内容与目的  37-38
  3.2 材料和方法  38-43
    3.2.1 amoA、nxrA、nirS基因克隆文库的构建  38-41
    3.2.2 克隆文库的RFLP分析  41-43
    3.2.3 amoA、nxrA、nirS文库克隆子的序列测定及系统发育进化树构建  43
  3.3 结果与讨论  43-53
    3.3.1 amoA、nxrA、nirS基因PCR产物的扩增与纯化结果  43-44
    3.3.2 amoA、nxrA、nirS基因阳性克隆子筛选结果  44-45
    3.3.3 amoA、nxrA、nirS基因阳性克隆子酶切结果  45-48
    3.3.4 amoA、nxrA、nirS阳性克隆子的分类  48-49
    3.3.5 amoA、nxrA、nirS基因克隆文库覆盖率及多样性指数分析  49-50
    3.3.6 amoA、nxrA、nirS文库克隆子序列的测定及系统发育进化树的构建  50-53
  3.4 本章小结  53-56
第四章 典型虾养殖水体中异养氨氧化细菌的筛选及鉴定  56-63
  4.1 引言  56-57
  4.2 材料和方法  57-59
    4.2.1 异养氨氧化细菌的筛选  57
    4.2.2 氨氧化细菌的鉴定  57-59
  4.3 结果与讨论  59-61
    4.3.1 菌株的筛选结果  59
    4.3.2 异养氨氧化菌的鉴定  59-61
  4.4 本章小结  61-63
结论与展望  63-65
参考文献  65-71
附录  71-85
攻读硕士学位期间取得的研究成果  85-86
致谢  86-87
附件  87

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中图分类: > 环境科学、安全科学 > 废物处理与综合利用 > 一般性问题 > 废水的处理与利用
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