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Issatchenkia terricola XJ-2乙醛脱氢酶的纯化和性质及其基因的克隆与表达

作　者: 姚正颖
导　师: 陆兆新
学　校: 南京农业大学
专　业: 食品科学
关键词: Issatchenkia terricola 乙醛脱氢酶分离纯化克隆表达酶学性质优化
分类号: TS201.25
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
下　载: 33次
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内容摘要

醛脱氢酶超家族(Aldehyde Dehydrogenase superfamily, E.C.1.2.1.x)是一类重要的氧化还原酶类,广泛存在于动物、植物和微生物中。醛脱氢酶(ALDH)具有相似的一级结构,依赖NAD(P)+为辅酶将脂肪族和/或芳香族的醛类氧化成相应的酸类,从而调整生物体中醛类的浓度水平。根据国际癌症研究机构(IARC)和大量的实验证据表明,乙醛具有诱变作用和致癌性,其致诱变浓度为40-1000μmol/L。由于醛脱氢酶超家族中的乙醛脱氢酶能有效降解乙醛,有必要对乙醛脱氢酶进行深入研究,以减轻或消除乙醛的危害。本论文主要对高活性的乙醛脱氢酶产生酵母的筛选、乙醛脱氢酶的分离纯化和性质,以及乙醛脱氢酶基因的克隆和异源高效表达进行了研究,旨在为从蛋白和分子水平研究乙醛脱氢酶的结构和催化机理等提供理论依据,并为乙醛脱氢酶的生产和应用奠定基础。主要研究结果分述如下：1.从新疆马奶葡萄中筛选了高产乙醛脱氢酶的酵母菌株并对其进行了鉴定。采用黄豆芽培养基初筛、摇瓶复筛的筛选策略,从南京果园土壤和新疆马奶葡萄中分离筛选到三株具有乙醛脱氢酶活性的酵母菌株,其中筛自马奶葡萄的酵母菌株XJ-2酶活最高,达6.28U/mL,比活力为2.28U/mg。建立顶空气相色谱法检测菌株XJ-2粗酶液反应体系中的乙醛和乙酸,直接证明了该粗酶液中具有能够将乙醛氧化成乙酸的乙醛脱氢酶。采用酵母26S rDNA D1/D2区域序列的通用引物对菌株XJ-2进行PCR扩增,获得554bp的片段。将该PCR产物在GenBank数据库中BLAST软件进行同源搜索比对,利用Clustal X1.83和MEGA4.0软件进行多重比较后绘制系统发育树,结果表明：酵母菌株XJ-2的26S rDNA D1/D2区域序列与陆生伊萨酵母(Issatchenkia terricola) MH509的26S rDNA D1/D2区域序列同源性达100%；在系统发育树中,菌株XJ-2与I. terricola在同一分支,亲缘关系最近。结合常规形态特征、生理生化特征,鉴定该菌株为陆生伊萨酵母(I. terricola)。2.对I. terricola XJ-2所产的乙醛脱氢酶进行了分离纯化并研究了其酶学性质。经硫酸铵分级沉淀、DEAE-sephacel阴离子交换层析和Bio-Gel HTP羟基磷灰石吸附层析,从菌株XJ-2的粗酶液中获得了电泳纯的乙醛脱氢酶,比活力达到了31.2U/mg,较粗酶液纯化了14.3倍,酶活回收率为14.7%。对乙醛脱氢酶纯酶进行SDS-PAGE和非变性PAGE电泳以及HPLC分析,结果表明该酶为同源四聚体结构。乙醛脱氢酶的最适反应温度和pH分别为50℃和9.0,在温度和pH分别为20-40℃和6.0-9.0的范围内稳定。乙醛脱氢酶有着较广的底物作用范围,偏好作用于短链脂肪族醛类,特别是丁醛和乙醛；能以NAD+和NADP+为辅酶,NAD+最佳。对乙醛的Km、Vmax、kcat和kcat/Km分别为0.73mmol/L、35.71U/mg、32.73/s和45.14×103/(mol·s)；对NAD+的Km和Vmax分别为0.24mmol/L和42.19U/mg。K+和NH4+是乙醛脱氢酶的激活剂,金属离子Mg2+、Ca2+、Ba2+、Co2+、Ni2+、Mn2+和化学试剂PMSF在1mmol/L和5mmol/L的浓度下对乙醛脱氢酶酶活具有一定程度的抑制作用,并随着浓度的增加而增强；Ag+、Cu2+、Zn2+、Hg2+则完全抑制了酶活性。还原剂2-ME和DTT对酶活有很强的促进作用。4.克隆了I. terricola XJ-2乙醛脱氢酶基因并进行序列分析。设计CODEHOP简并引物进行PCR扩增获得了乙醛脱氢酶基因的保守区序列,利用SiteFinding-PCR和Self-formed adaptor PCR染色体步移技术扩增了保守区的旁邻序列。经序列分析和拼接获得了I. terricola XJ-2乙醛脱氢酶基因(ist-ALD)的开放阅读框,长度为1578bp。对该基因编码的蛋白(ist-ALDH)进行生物信息学分析可知,ist-ALDH由525个氨基酸组成,预测分子量为57.2kDa；与Pichia angusta的ALDH(AAA83769)氨基酸序列的相似性达到73%,亲缘关系最近；含有16个在ALDH超家族中高度保守的氨基酸残基和10个保守性较高的氨基酸基元序列；预测Glu293和Cys327是其的催化活性位点以及第三和第四基元序列之间的氨基酸序列(GFGKTIG)是辅酶NAD(P)+的特异性结合位点。将ist-ALDH的氨基酸序列提交至http://swissmodel.expasy.org蛋白质在线分析服务器,预测其亚基的三级结构模型。该模型含有三个ALDH亚基的特征结构域：催化结构域、辅酶结合结构域和寡聚化结构域。通过一系列氨基酸序列分析证明了ist-ALD基因编码的蛋白是ALDH超家族的新成员。4.实现了I. terricola XJ-2的乙醛脱氢酶基因在大肠杆菌中的异源表达并研究了重组酶的性质。构建了非融合表达载体pET-23a-ist-ALD)和融合表达载体pET-32a-ist-ALD,将其分别转化到E. coli BL21(DE3)中均获得了活性表达,其中E. coli BL21/pET-32a-ist-ALD表达的重组乙醛脱氢酶活力最高,达到44.23U/mL,比活力为10.95U/mmg,是天然酶比活力的4.8倍。重组酶ist-ALDH经凝血酶酶切和Ni-NTA一步分离纯化,达到了电泳纯,纯化倍数为8.99倍,回收率为18.06%。通过SDS-PAGE和非变性PAGE电泳测定重组酶的分子量分别为57kDa和232kDa,表明该酶是同源四聚体。ist-ALDH的最适反应温度和pH分别为40℃和9.0,在温度和pH分别为20-37℃和7.0-9.0的范围内稳定。与天然酶的酶学性质比较可知,重组酶ist-ALDH的最适反应温度较天然酶低10℃,热稳定性稍差,但其它酶学性质则与天然酶的基本一致。5.对重组大肠杆菌高效表达乙醛脱氢酶的条件进行了优化并对重组大肠杆菌细胞转化清除乙醛的进行了研究。通过单因素试验选择TB5培养基作为重组菌E. coliBL21(DE3)pET32a-ist-ALD的表达培养基,并确定了诱导剂乳糖的诱导时机为OD600=3.0-3.2、添加量为140μg/mL。通过Plackett-Burman试验和中心组合设计试验快速筛选出了影响重组大肠杆菌表达乙醛脱氢酶的关键因子并对其实现了条件优化：当诱导时间、装液量和接种量分别为20.68h、126.75mL和3%时,获得重组乙醛脱氢酶的酶活为496.65U/mL,较未优化前的44.23U/mL提高了12.5倍。以最佳表达条件下培养的重组大肠杆菌为催化剂,通过对反应pH、反应温度、表面活性剂、底物浓度和NAD+浓度等因素对重组菌细胞转化清除乙醛的影响进行考察和分析,获得了细胞反应体系的最佳组成为：0.1mol/LGlycine-NaOH缓冲体系(pH9.5)、1mmol/L乙醛、2mmol/L NAD+、10mmol/L2-巯基乙醇,0.1mol/L KCl以及经0.075%(v/v)Triton X-100处理的湿菌体(1mg/mL)。当该体系于40℃反应15min,乙醛转化率为98%,细胞平均转化力为3.92mmol/g cells/h。

全文目录

摘要  7-10
ABSTRACT  10-14
表格索引  14-16
图形索引  16-21
缩写符号  21-23
第一章文献综述  23-53
  1 醛类简介  23-24
    1.1 醛类的来源和作用  23
    1.2 乙醛及其毒性  23-24
  2 醛脱氢酶研究进展  24-38
    2.1 ALDH的来源和分类  25-28
    2.2 ALDH的重要生理功能  28-29
    2.3 ALDH的结构  29-30
    2.4 ALDH的催化机理  30-32
    2.5 微生物来源的ALDH  32-37
    2.6 ALDH的应用现状  37-38
  3 基因克隆与表达  38-41
    3.1 基于随机引物PCR的染色体步移技术研究进展  39-40
    3.2 大肠杆菌pET表达系统  40-41
  4 研究目的、意义及内容  41-43
  参考文献  43-53
第二章产乙醛脱氢酶酵母菌株的分离和鉴定  53-67
  1 材料与方法  53-57
    1.1 材料  53-55
    1.2 方法  55-57
  2 结果与分析  57-61
    2.1 产乙醛脱氢酶酵母菌株的筛选  57
    2.2 HS-GC检验菌株XJ-2的乙醛脱氢酶活力  57-58
    2.3 菌株XJ-2的鉴定  58-61
  3 讨论  61-62
  4 本章小结  62-64
  参考文献  64-67
第三章 I.terricola XJ-2乙醛脱氢酶的分离纯化及其酶学性质的研究  67-89
  1 材料与方法  67-71
    1.1 材料  67-68
    1.2 方法  68-71
  2 结果与分析  71-82
    2.1 乙醛脱氢酶的分离纯化  71-75
    2.2 乙醛脱氢酶的分子量  75
    2.3 乙醛脱氢酶的最适反应温度  75-76
    2.4 乙醛脱氢酶的热稳定性  76-77
    2.5 乙醛脱氢酶的最适反应pH  77-78
    2.6 乙醛脱氢酶的pH稳定性  78-79
    2.7 金属离子对乙醛脱氢酶活力的影响  79-80
    2.8 化学试剂对乙醛脱氢酶活力的影响  80
    2.9 乙醛脱氢酶的底物特异性  80-81
    2.10 乙醛脱氢酶的动力学常数  81-82
  3 讨论  82-84
  4 本章小结  84-85
  参考文献  85-89
第四章 I.terricola XJ-2乙醛脱氢酶基因克隆、表达及重组酶性质的研究  89-131
  1 材料与方法  89-103
    1.1 材料  89-91
    1.2 方法  91-103
  2 结果与分析  103-124
    2.1 酵母I.terricola XJ-2基因组DNA的提取  103-104
    2.2 乙醛脱氢酶基因保守区的克隆  104-106
    2.3 乙醛脱氢酶全长基因的克隆  106-110
    2.4 I.terricola XJ-2乙醛脱氢酶基因序列(ist-ALD)分析  110-112
    2.5 I.terricola XJ-2乙醛脱氢酶(ist-ALDH)氨基酸序列分析  112-115
    2.6 I.terricola XJ-2乙醛脱氢酶基因ist-ALD的扩增  115
    2.7 pET-23a-ist-ALD的构建与验证  115-116
    2.8 pET-32a-ist-ALD的构建与验证  116-117
    2.9 ist-ALD基因在大肠杆菌中的诱导表达  117
    2.10 重组乙醛脱氢酶表达形式鉴定  117-118
    2.11 重组质粒稳定性检测  118-119
    2.12 重组酶ist-ALDH的纯化  119
    2.13 重组酶ist-ALDH酶学性质的研究  119-124
  3 讨论  124-127
  4 本章小结  127-129
  参考文献  129-131
第五章重组大肠杆菌诱导表达乙醛脱氢酶的条件优化及细胞转化清除乙醛的研究  131-157
  1 材料与方法  131-136
    1.1 试验材料  131-133
    1.2 试验方法  133-136
  2 结果与分析  136-151
    2.1 菌体生长量的测定  136-137
    2.2 单因素试验  137-139
    2.3 影响重组大肠杆菌表达乙醛脱氢酶关键因子的筛选  139-141
    2.4 响应曲面法优化表达培养条件  141-146
    2.5 重组大肠杆菌细胞转化清除乙醛的研究  146-151
  3 讨论  151-153
  4 本章小结  153-155
  参考文献  155-157
全文结论  157-159
论文创新点  159-161
展望  161-163
致谢  163-165
攻读博士期间发表论文及申请专利情况  165

Issatchenkia terricola XJ-2乙醛脱氢酶的纯化和性质及其基因的克隆与表达

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