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噬菌体聚糖酶在细菌生物被膜降解中的应用研究

作　者: 柴子涵
导　师: 牟海津
学　校: 中国海洋大学
专　业: 食品工程
关键词: 噬菌体生物被膜聚糖酶胞外多糖克雷伯氏菌K13
分类号: TS201.25
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

细菌生物被膜（biofilm, BF）的控制是食品工业的一大难题，它为被膜菌在不良环境下的存活和生长提供了一种保护性结构，使其更容易引发食品腐败、设备腐蚀和食源性疾病等危害。普通的消毒杀菌措施很难实现对成熟生物被膜细菌的彻底清除，甚至导致细菌的抗药性造成更严重的后果。生物被膜的主要组成成分为胞外多糖（exopolysaccharide, EPS），借助于噬菌体及其聚糖酶的酶解技术，为降解生物被膜提供了一种新型安全高效的方法。本文以克雷伯氏菌血清型K13为出发菌株，侵染K13的噬菌体P13及其聚糖酶为工具，研究了噬菌体及其酶对生物被膜的降解作用。生物被膜是细菌在一定条件下接触各种材质表面时的一种生长形式，菌体细胞之间以胞外物质相互连结在一起形成空间网状具有一定密度的结构，这种结构帮助细菌抵制各种不良环境而使其更好的生存、生长和繁殖。细菌胞外多糖是胞外物质的主要成分，和无机盐离子、菌体、水等共同构成生物被膜。由添加KH2PO4和葡萄糖的营养肉汤培养基培养构建了生长于玻璃片上的生物被膜，定性染色法及定量平板擦拭计数法表明克雷伯氏菌K13在培养一天时形成成熟的生物被膜。噬菌体聚糖酶能够高效降解细菌胞外多糖并具有良好的热稳定性。该酶在噬菌体侵染细菌并结合至宿主细胞表面的多糖物质时被释放出来，随之多糖物质被酶解，进而噬菌体能够到达细菌表面受体裂解细菌。噬菌体聚糖酶经过1:2添加比的丙酮沉淀后可达到最大限度的浓缩，从而达到较高的酶活，同时消除了大部分噬菌体。经75C10分钟处理后，初始效价为2.3×109PFU/ml的K13噬菌体被完全灭活，而这种热处理方式仍能保证该酶较高的酶活。噬菌体聚糖酶对生物被膜具有显著降解作用，平板擦拭计数法显示酶处理4h对生物被膜细菌数量的影响最为显著，80%的细菌被清除。含有噬菌体聚糖酶的噬菌体裂解液对生物被膜也表现出较强的降解作用，在处理4h时可达到88%的被膜菌清除率。噬菌体聚糖酶预处理还可有效提高消毒剂二氧化氯对生物被膜细菌的清除率。实验通过扫描电镜（scanning electron microscope, SEM）观察酶处理不同时间的生物被膜中被膜菌及胞外多糖的结构变化、单位面积生物被膜细菌群落数量的变化，观察结果表明，噬菌体聚糖酶能够有效减少处于连结状态的细菌和生物被膜中的胞外物质，当酶作用6h时，单位面积视野内仅剩下少量的被膜菌，被膜菌之间的连结物质几乎全部被清除。研究表明K13噬菌体聚糖酶对生物被膜具有高效的降解性能，有可能开发成为一种去除生物被膜的重要工具。利用噬菌体及其聚糖酶降解生物被膜的研究仍很少，它们作为一种特殊的新型工具，结合定量平板擦拭计数法、扫描电镜以及其他染色技术，可以开发为研究细菌生物被膜的重要技术。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-13
0 前言  13-32
  0.1 生物被膜  13-20
    0.1.1 生物被膜概述  13
    0.1.2 生物被膜的结构  13-14
    0.1.3 生物被膜的形成  14-16
    0.1.4 食品工业中生物被膜的危害  16
    0.1.5 生物被膜的耐药性  16-17
    0.1.6 控制生物被膜的方法  17-19
    0.1.7 控制生物被膜现状  19-20
  0.2 克雷伯氏菌  20-21
    0.2.1 菌体概况  20
    0.2.2 细菌胞外多糖  20-21
  0.3 噬菌体聚糖酶  21-22
    0.3.1 噬菌体聚糖酶的特点  21
    0.3.2 噬菌体聚糖酶的应用  21-22
  0.4 生物被膜检测方法  22-25
    0.4.1 定性观察  22-23
    0.4.2 定量检测  23-25
  0.5 研究展望  25-26
  参考文献  26-32
1 Klebsiella K13 生物被膜的构建  32-42
  引言  32
  1.1 试验材料  32-34
    1.1.1 试验试剂  32-33
    1.1.2 试验仪器  33
    1.1.3 试验菌种及其它材料  33-34
    1.1.4 培养基  34
    1.1.5 磷酸缓冲液  34
  1.2 方法  34-36
    1.2.1 生物被膜的构建  34-35
    1.2.2 生物被膜的检测  35-36
  1.3 结果与讨论  36-40
    1.3.1 刚果红染色  36
    1.3.2 结晶紫染色观察生物被膜  36-37
    1.3.3 银染法观察生物被膜  37-38
    1.3.4 吖啶橙染色观察生物被膜  38-39
    1.3.5 平板擦拭法定量检测  39-40
  1.4 本章小结  40
  参考文献  40-42
2 噬菌体 P13 聚糖酶的制备及其活性分析  42-53
  引言  42-43
  2.1 试验材料  43-45
    2.1.1 试验试剂  43
    2.1.2 试验仪器  43-44
    2.1.3 试验菌种及其它材料  44
    2.1.4 培养基  44
    2.1.5 试剂配制  44-45
  2.2 方法  45-47
    2.2.1 噬菌体 P13 的基本特性  45-46
    2.2.2 Klebsiella K13 胞外多糖（EPS）的提取  46
    2.2.3 噬菌体聚糖酶的制备  46-47
  2.3 结果与讨论  47-51
    2.3.1 噬菌体 P13 裂菌图观察  47-48
    2.3.2 噬菌体 P13 效价测定结果  48
    2.3.3 噬菌体聚糖酶的酶活测定  48-49
    2.3.4 丙酮添加比例对噬菌体聚糖酶的影响  49-50
    2.3.5 温度对噬菌体聚糖酶的影响  50-51
  2.4 本章小结  51-52
  参考文献  52-53
3 噬菌体聚糖酶对生物被膜降解作用的研究  53-68
  引言  53-54
  3.1 试验材料  54-56
    3.1.1 试验试剂  54
    3.1.2 试验仪器  54-55
    3.1.3 试验菌种及其它材料  55
    3.1.4 培养基  55
    3.1.5 磷酸缓冲液  55-56
  3.2 方法  56-57
    3.2.1 噬菌体对生物被膜作用的定量分析  56
    3.2.2 噬菌体聚糖酶对生物被膜作用的定量分析  56
    3.2.3 消毒剂以及酶和消毒剂先后加入对生物被膜作用的定量分析  56-57
    3.2.4 噬菌体聚糖酶对生物被膜作用的定性分析  57
  3.3 结果与讨论  57-66
    3.3.1 平板擦拭计数法测定噬菌体对生物被膜的作用效果  57-58
    3.3.2 平板擦拭计数法测定噬菌体聚糖酶对生物被膜的作用效果  58-59
    3.3.3 平板擦拭计数法测定消毒剂及酶和消毒剂先后加入对生物被膜的作用效果  59-60
    3.3.4 荧光显微镜观察结果  60-62
    3.3.5 扫描电镜观察结果  62-66
  3.4 本章小结  66-67
  参考文献  67-68
结语  68-70
创新点  70-71
展望  71-72
致谢  72-73
个人简历  73-74
学术论文  74

噬菌体聚糖酶在细菌生物被膜降解中的应用研究

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