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DCs靶向温度敏感性siRNA载体的构建

作　者: 周琳
导　师: 崔京浩
学　校: 苏州大学
专　业: 药剂学
关键词: 树突状细胞 siRNA 温度敏感纳米胶束 DEC-205
分类号: TQ460.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

背景与目的：树突状细胞（dendritic cells，DCs）是体内功能最强的专职抗原递呈细胞，在天然和获得性免疫、炎症与肿瘤的防治过程中发挥着关键作用。DCs的体内数量少，生命周期命短，目前采用体外培养后与疫苗一起注入体内的免疫治疗方法。但是，该方法存在技术难度高、易出现外源性抗原反应等问题，限制了其广泛的临床应用。因此，针对提高DCs靶向性以及延长其寿命的给药系统设计研究，日益受到人们的关注。据文献报道，DCs中的Bak蛋白表达具有促进细胞凋亡的作用。RNA干扰技术是一种调控细胞某种特定基因表达的有效方法，但其给药系统研究尚处于方兴未艾的状态。所以，研究有效的DCs的Bak蛋白沉默RNA负载给药系统，对提高DCs的抗原提呈能力、促进免疫应答和增强抗肿瘤作用均具有非常积极的意义。本文基于DCs表面有DEC-205受体表达的特点，旨在制备新型抗体修饰siRNA负载温敏性纳米胶束，并对其制剂学性质、摄取能力、细胞毒性、siRNA的沉默效率和对DCs存活率等进行评价，以便为其给药系统优化设计与体内评价提供依据。方法：首先，根据本研究室前期建立的方法，合成并表征了温度敏感性泊洛沙姆接枝壳聚糖聚合物结构（Po-CS），并对聚合物纳米胶束的粒径、Zeta电位、包封率和安全性进行了评价。其次，采用体外诱导小鼠骨髓中单个核细胞分化法获得DCs，以Lipofectamine2000为对照载体，通过荧光显微镜、流式细胞仪分别考察了巨噬细胞和DCs对FAM-siRNA负载DEC-205-Po-CS-的摄取率。最后，利用Western Blot评价了影响Bak蛋白表达的因素，并采用凋亡试剂盒测定了Bak沉默siRNA负载纳米胶束转染后的DCs存活率。结果：红外光谱、核磁共振图谱及热分析结果证实了泊洛沙姆接枝壳聚糖聚合物的合成，其CMC值和LCST值分别为（1.39±0.08）×10^-6mol·L-1和40℃。根据体外实验确立的接枝物和siRNA给药浓度分别为0.5mg·mL-1和120nM，所制得载药纳米胶束粒径为（230±4.1） nm，Zeta-电位为+（13.98±0.8） mV，包封率为（80.2±2.93）%，且重现性良好。荧光显微镜和流式细胞仪的检测结果表明，巨噬细胞（RAW264.7）和DCs对含有FAM-siRNA纳米胶束的摄取明显高于游离的FAM-siRNA；DEC-205修饰对RAW264.7摄取温敏性纳米胶束影响不大，但可提高DCs的摄取率。siRNA负载DEC-205-Po-CS与DCs共孵育48h后，经Western Blot分析，Bak蛋白表达抑制率为（80.17±6.90）%；流式细胞仪检测DCs凋亡结果，DCs存活率（64.12±1.82）%明显高于对照组（41.08±1.99）%和脂质体2000转染组（50.45±8.13）%。结论：本文制备了温敏性的DEC-205修饰siRNA负载泊洛沙姆接枝壳聚糖聚合物，未见明显细胞毒性。巨噬细胞和树突状细胞的转染试验结果表明，所制得纳米胶束能有效地提高细胞对FAM-siRNA的摄取，且对DCs具有一定的特异性。通过RNA干扰技术特异性阻断了DCs中Bak蛋白表达，达到了延长DCs寿命的目的。

全文目录

中文摘要  4-6
Abstract  6-12
第一章文献综述  12-22
  1 树突状细胞  12-15
    1.1 DCs 的来源及分化  12-13
    1.2 DCs 的体外培养与扩增  13
    1.3 DCs 抗肿瘤机制  13-14
    1.4 DCs 主动靶向研究进展  14-15
  2 Bak 基因  15-17
    2.1 Bak 基因的发现  16
    2.2 Bak 基因的功能及机制  16-17
  3 RNA 干扰  17-20
    3.1 RNA 干扰的机制  17
    3.2 RNA 干扰的特点  17-18
    3.3 RNA 干扰的载体  18-20
  4 Poloxamer 及 Chitosan 介绍  20-21
  5 本研究的意义和目的  21-22
第二章 DEC-205 修饰的泊洛沙姆壳聚糖聚合物的合成  22-33
  1 实验仪器和试剂  22-23
    1.1 实验试剂  22
    1.2 实验仪器  22-23
  2 实验方法  23-25
    2.1 壳聚糖的纯化  23
    2.2 合成路线  23-24
    2.3 合成步骤  24
    2.4 热重分析（TGA）  24
    2.5 临界胶束浓度（CMC）的测定  24-25
    2.6 低临界溶液温度（LCST）的测定  25
  3 实验结果  25-32
    3.1 合成过程中的中间产物的表征  25-30
    3.2 热重分析结果（TGA）  30-31
    3.3 聚合物溶液的临界胶束浓度（CMC）  31-32
    3.4 聚合物溶液的低临界温度（LCST）  32
  4 本章小结  32-33
第三章负载 siRNA 纳米胶束的制备及制剂学评价  33-39
  1 实验材料和仪器  33
    1.1 材料  33
    1.2 仪器  33
  2 溶液配制  33-34
  3 实验方法  34-35
    3.1 FAM-siRNA 荧光分析方法的确定  34-35
    3.2 纳米胶束的制备与表征[81]  35
    3.3 包封率的测定  35
    3.4 RNase 稳定性试验  35
  4 实验结果  35-38
    4.1 标准曲线  35-36
    4.2 纳米胶束的制备与表征结果  36-38
    4.3 RNase 稳定性实验  38
  5. 本章小结  38-39
第四章巨噬细胞对纳米胶束的摄取  39-48
  1 实验材料和仪器  39-40
    1.1 材料  39-40
    1.2 仪器  40
    1.3 细胞株  40
  2 溶液的配制  40-41
  3 实验方法  41-43
    3.1 巨噬细胞的培养  41
    3.2 细胞毒性实验  41-42
    3.3 细胞摄取实验  42
    3.4 Western Blot 检测 Bak 蛋白表达  42-43
    3.5 数据的分析  43
  4 实验结果  43-47
    4.1 细胞毒性实验  43-44
    4.2 细胞摄取实验  44-47
    4.3 Westrn Blot 检测 Bak 蛋白的表达  47
  5 小结  47-48
第五章树突状细胞对纳米胶束的摄取  48-63
  1 实验材料和仪器  48-49
    1.1 材料  48-49
    1.2 仪器  49
    1.3 实验动物  49
  2 溶液的配置  49
  3 实验方法  49-52
    3.1 树突状细胞（DCs）的培养[82,83]  49-50
    3.2 细胞毒性实验  50
    3.3 细胞摄取实验  50-51
    3.4 Western Blot 检测 Bak 蛋白水平  51
    3.5 流式细胞仪检测细胞凋亡  51
    3.6 数据分析  51-52
  4 实验结果  52-61
    4.1 DCs 体外培养的生长情况  52-53
    4.2 DCs 表型测定  53
    4.3 细胞毒性实验  53-54
    4.4 细胞摄取实验  54-57
    4.5 Western Blot 测定 Bak 蛋白的表达  57-60
    4.6 流式细胞仪检测凋亡  60-61
  5 小结  61-63
全文结论和展望  63-64
  全文结论  63
  展望  63-64
参考文献  64-71
攻读硕士学位期间公开发表的论文  71-72
致谢  72-73

DCs靶向温度敏感性siRNA载体的构建

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