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去甲斑蝥素—聚乙二醇—聚已内酯嵌段共聚物胶束的研制

作　者: 陈水钫
导　师: 陈建海
学　校: 南方医科大学
专　业: 药剂学
关键词: 去甲斑蝥素抗肿瘤聚乙二醇-聚已内酯共聚物胶束
分类号: TQ460.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

背景：由亲水端聚乙二醇(PEG)和疏水端聚已内酯(PCL)组成的两亲性嵌段共聚物材料聚乙二醇-聚已内酯(PEG-PCL),由于具有生物相容性和可降解性的特点,备受人们的关注。在水中,PEG-PCL自组装形成含有疏水内核和亲水外核的胶束结构。聚合物胶束给药系统是近年来研究十分活跃的抗肿瘤给药系统。胶束既提供了一个疏水的内核作为药物储库,又提供了一个亲水的外膜以维持在水性环境中的稳定性。正是由于特殊的结构,胶束可以增加药物在体内外的稳定性,增加疏水性药物的溶解性,并改善药物分子的传递性能。作为新型的药物传递系统,聚合物胶束还具备有其他诱人的性质,诸如具有良好的生物相容性,增加生物利用度等。由于胶束具有较小的粒径,因此它很容易通过“渗透和保留”(ERP)效应聚集在肿瘤组织,起到靶向作用,同时还能减轻对正常组织的毒副作用。本课题就是利用PEG-PCL两嵌段共聚物包载抗肿瘤药去甲斑蝥素(NCTD)。去甲斑蝥素是斑蝥素经去甲基结构改造而来的。斑蝥素是我国昆虫大斑蝥(mylabris)干燥虫体的有效成分。研究表明,去甲斑蝥素具有较强的抗肿瘤活性,且抑瘤谱广,对原发性肝癌,结肠癌,口腔癌,肺癌,卵巢癌及乳腺癌等均有效。去甲斑蝥素的抗肿瘤机制主要是抑制肿瘤细胞的增值,诱导细胞凋亡以及阻止细胞迁移运动。但是,由于去甲斑蝥素水溶性差及对泌尿系统的刺激作用强,因此它的临床应用受到很大的限制。药物溶解度是影响药物释放和吸收的重要因素,然而去甲斑蝥素的溶解性并不让人乐观,在pH=6.0的水中溶解度仅为2.5mg/mL,当pH=9.5时,它的溶解度涨至9.5mg/mL。临床上,去甲斑蝥素通常以pH=9的钠盐注射于人体内,高的pH值是去甲斑蝥素用于静脉注射产生强刺激性的重要因素。经结构改造后的去甲斑蝥素毒性虽然有所降低,但是对泌尿系统的刺激仍然存在,当用药剂量较大或长期用药后,由于药物在各组织器官分布广泛,对机体可产生明显的不良反应,这是限制了其在临床上应用的又一原因。因此应该把开发去甲斑蝥素的新剂型放在第一位,其目的在于改善药物的溶解性,降低毒性,增强疗效。本课题的目的在于制备去甲斑蝥素-聚乙二醇-聚已内酯的聚合物胶束并优化其工艺。通过透射电镜验证胶束结构的形成,并通过红外光谱验证药物被包载在胶束里核。检测聚合物的临界胶束浓度在于说明胶束的耐稀释性。比较冻干品与去甲斑蝥素的稳定性。体外释放性能,体外抗肿瘤活性及体内抗肿瘤活性等研究是为了阐述载药胶束潜在的临床应用价值。第一部分：去甲斑蝥素-聚乙二醇-聚已内酯两嵌段共聚物胶束的制备及工艺优化聚合物胶束的制备采用透析法和挥发透析法,用高效液相色谱(HPLC)测定药物浓度,析因设计优化制备工艺,以载药量,包封率和粒径的综合值(OD)作为考察指标。单因素考察结果表明制备方法,有机溶剂的种类以及药物与聚合物的投料比影响OD值的大小,因此将这三因素作为考察因素。析因设计结果表明：当制备方法为挥发透析法,溶剂为四氢呋喃,投料比为0.0625：1时制得的聚合物胶束粒径为(95.6±10.1)nm,载药量为(6.0±0.3)%,包封率为(79.1±0.8)%,此时的OD值最大。第二部分：表征PEG-PCL聚合物临界胶束浓度(CMC)的测定：采用荧光探针法测定PEG-PCL的CMC,制备一系列不同浓度的空白胶束溶液,分别加入相同量的芘,在发射波长393nm处,测定各样品在335nm和338nm处的激发光强度,以1gC为横坐标,I338/335为纵坐标作图,拐点处即为该聚合物的CMC,实验得PEG-PCL的CMC为0.3×10-6mol·L-1。当CMC达到10-6级,胶束能够保持在体内外的稳定性,即使在体液的稀释中也能保持完整的结构。载药胶束和空白胶束粒径大小比较：用马尔文粒径测定仪测量在相同制备条件下制得的载药胶束和空白胶束的粒径大小。结果显示：空白胶束的粒径为(126.55±0.28)nm,载药胶束的粒径为(87.12±0.17)nm,显然,载药胶束的粒径反而小于空白胶束。药物进人胶束内核后与聚已内酯发生了范德华力,氢键等作用,空间被压缩,因此粒径小于空白胶束。胶束形态观察：采用透射电镜(TEM)观察空白胶束和载药胶束的形态和粒径大小。首先进行样品的负染色,将样品滴到碳膜铜网上,待干后用2%的磷钨酸负染色,最后于透射电镜下观察。透射电镜观察到空白胶束和载药胶束除了粒径大小外,在形状上没有显著性差别,均呈球形的核-壳结构,胶束的亲水段因吸收了磷钨酸所以显深黑色,里核的疏水部分未吸收磷钨酸所以呈浅色。透射电镜结果表明在胶束构建过程中,核-壳结构已完全形成。红外(IR)表征：将空白胶束,载药胶束,聚合物和去甲斑蝥素的物理混合物三者完全干燥后加适量KBr压片,用傅里叶红外光谱观察三者的红外吸收。结果显示载药胶束和空白胶束具有相同的红外吸收峰,而这些吸收均为PEG-PCL的特征吸收峰。药物和聚合物的物理混合物既显现了聚合物的特征吸收,还显现了去甲斑蝥素的特征吸收峰。红外光谱结果表明：未被包载的游离药物已被除尽,IR是控制聚合物胶束纯度的好方法。第三部分：稳定性研究冻干保护剂的选择：采用半乳糖,甘露醇,海藻糖作为冻干保护剂,考察不同冻干保护剂对载药胶束的外观形态、粒径及分布的影响。结果显示：用海藻糖作为冻干保护剂制得的冻干品外观形态良好且具有最小的粒径。稳定性：将胶束冻干粉和去甲斑蝥素分别都置于40℃,60℃,强光下,1、3、5、10d后采样,考察不同条件下胶束和去甲斑蝥素的保存率。把冻干制剂和去甲斑蝥素放在75%和92.5%湿度条件下,1、3、5、10d后采样后,检查重量变化率。结论：1.40℃下,胶束10d后的保存率显著高于去甲斑蝥素。2.胶束冻干品不耐60℃的高温,在60℃下,冻干品开始融化。因此冻干品在保存过程中要避免高温的破坏。3.强光下,胶束和去甲斑蝥素10d后的保存率没有显著性差异。4.去甲斑蝥素易吸潮,制成胶束冻干粉后可以改善药物的湿稳定性。室温留样考察胶束冻干样品的稳定性：将胶束冻干品于室温下密封放置,于第0,1,2,3个月取样,检测粒径和包封率。实验结果表明冻干样品在常温下密封放置三个月后胶束的粒径和包封率没有显著变化。第四部分：体外释放性能与细胞毒性实验体外释放研究：精密量取相同体积的胶束溶液于透析袋中,置于含一定量的释放介质(磷酸盐缓冲液含1%SDS,pH分别为6.5,7.0,7.4)的EP管中,37℃恒温振荡(100r·min-1),分别于不同的时间点下将释放液全部取出,同时注入相同量的新鲜释放介质。高效液相测定药物浓度,并作累积释放曲线。结果显示：72h后,药物从胶束中释放到pH为6.5,7.0,7.4的释放液的量分别为(83.4±2.5)%,(80.0±1.6)%和(72.0±1.5)%。结论：载药胶束在pH低于正常组织(pH=7.4)的肿瘤区(pH=6.5到7.0)能够释放出更多的药物。体外细胞毒性实验：选择肝癌细胞(HepG2),(?)(?)癌细胞(A549),卵巢癌细胞(A2780)以及人正常肝细胞LO2作为靶细胞,采用MTT法比较载药胶束和去甲斑蝥素对上述肿瘤细胞的抑制作用,绘制细胞存活率对浓度的曲线。实验结果显示：载药胶束和去甲斑蝥素对肿瘤细胞的抑制作用均呈浓度和时间依赖性。肿瘤细胞对胶束的敏感性高于去甲斑蝥素。相比于去甲斑蝥素,载药胶束对A549和A2780的抑制增强作用强于HepG2。用SPSS得到的IC50值同样能说明相同的问题。载药胶束在增强对肿瘤细胞抑制作用的同时也增强了对正常肝细胞LO2的抑制作用。第五部分：体内抗肿瘤活性研究昆明小鼠30只,接种小鼠肉瘤细胞S180后,随即分成五组,每组六只。分别为生理盐水组,阳性对照组,载药胶束低剂量组,载药胶束中剂量组,载药胶束高剂量组。接肿瘤24h后连续八天给予尾静脉注射药物,并每天用游标卡尺测小鼠肿瘤大小变化。第九天将小鼠处死剥瘤并称瘤重,计算抑瘤率。结果表明：与裸药组相比,载药胶束对肿瘤抑制作用具有显著性增强(P<0.05),高浓度组载药胶束的抑瘤率高达77.63%。通过体内实验,我们得到这样的结论：聚合物胶束通过被动靶向作用和ERP效应将药物累积到肿瘤组织,提高肿瘤区的药物浓度,从而增强了药物的抗肿瘤活性。体内实验结果为去甲斑蝥素-聚乙二醇-聚已内酯聚合物胶束应用于临床提供了科学的依据。

全文目录

摘要  3-8
ABSTRACT  8-18
第一章绪论  18-28
  1.1 去甲斑蝥素的研究  20-22
    1.1.1 结构特点  20
    1.1.2 临床应用  20-21
    1.1.3 应用限制  21-22
  1.2 聚合物胶束的研究  22-27
    1.2.1 两嵌段共聚物—聚乙二醇-聚已内酯  22-23
    1.2.2 聚合物胶束  23-27
  1.3 本课题的意义,目的和内容  27-28
第二章去甲斑蝥素-聚乙二醇-聚已内酯聚合物胶束的制备及工艺优化  28-42
  2.1 材料与仪器  28-29
  2.2 方法与结果  29-39
    2.2.1 聚合物胶束的制备方法  29
    2.2.2 聚合物胶束粒径的测量  29
    2.2.3 含量测定方法的建立  29-32
    2.2.4 载药量和包封率的测定  32
    2.2.5 工艺优化  32-39
  2.3 讨论  39-41
  2.4 小结  41-42
第三章表征  42-50
  3.1 仪器和试剂  42
  3.2 方法和结果  42-47
    3.2.1 PEG-PCL分子量的确定  42-43
    3.2.2 PEG-PCL临界胶束浓度的测定  43-45
    3.2.3 载药胶束和空白胶束的粒径比较  45
    3.2.4 胶束形态和大小的观察  45-46
    3.2.5 红外光谱分析鉴定  46-47
  3.3 讨论  47-48
  3.4 小结  48-50
第四章稳定性试验  50-63
  4.1 材料与仪器  50
  4.2 方法与结果  50-61
    4.2.1 冻干保护剂的选择  50-52
    4.2.2 稳定性试验  52-61
  4.3 讨论  61-62
  4.4 小结  62-63
第五章体外释放性能与细胞毒性实验  63-83
  5.1 试剂与仪器  63-64
  5.2 方法与结果  64-81
    5.2.1 体外释放性能研究  64-67
    5.2.2 体外抗肿瘤活性研究  67-79
    5.2.3 载药胶束和去甲斑蝥素对人正常肝细胞LO_2的作用  79-81
  5.3 讨论  81-82
  5.4 小结  82-83
第六章体内抗肿瘤活性  83-90
  6.1 试剂与仪器  83
    6.1.1 细胞和动物  83
    6.1.2 试剂与耗材  83
  6.2 方法与结果  83-88
    6.2.1 活性S180小鼠肉瘤细胞的获得  83-84
    6.2.2 小鼠肿瘤模型建立  84
    6.2.3 实验结果  84-88
  6.3 讨论  88-89
  6.4 小结  89-90
第七章结论与展望  90-93
  7.1 全文小结  90-91
  7.2 创新点  91
  7.3 研究展望  91-93
参考文献  93-101
硕士期间发表文章  101-102
附录  102-103
致谢  103-105
统计学证明  105

去甲斑蝥素—聚乙二醇—聚已内酯嵌段共聚物胶束的研制

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