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促红细胞生成素（EPO）糖基化修饰位点的傅立叶变换离子回旋共振质谱法研究

作　者: 赵迎晨
导　师: 戴新华
学　校: 中国计量科学研究院
专　业: 测试计量技术与仪器
关键词: 重组人促红细胞生成素(rhEPO) 傅立叶变换离子回旋共振质谱法(FT-ICRMS) 液相色谱-线性离子阱质谱法(LC-LTQ-MS) 糖基化位点电子捕获解离(ECD) 碰撞活化解离(CAD)
分类号: R91
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
下　载: 23次
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内容摘要

兴奋剂中重组蛋白的检测是一项非常艰巨的工作,其中典型蛋白质如rhEPO自1990年WADA和IOC禁用到2000年官方检测方法出台用了十年多的时间。但此检测过程耗时费力,对检验员实验技巧的要求也很高,而且所有这些方法都有产生检测假阳性的可能。傅立叶变换离子回旋共振质谱仪(FT-ICRMS)具有高分辨率,高灵敏度,宽的质量范围,多重独特的裂解技术,可以鉴定蛋白质翻译后修饰位置及修饰结构,实现混合物中目标物的准确检测,具有很好的定量优势,不仅在肽类兴奋剂滥用检测中有良好的应用前景,而且在临床低含量蛋白质基体样品的准确测量中有很高的实用价值。重组人促红细胞生成素(rhEPO)是一种具有典型代表性的糖蛋白,含有三个N-连接糖基化位点和一个O-连接糖基化位点。本研究采用蛋白酶Glu-C有效的酶解了EPO-a样品,利用液相色谱-线性离子阱质谱法鉴定了EPO-a样品酶解后的多肽片段和糖肽片段,通过碰撞活化解离(CAD)分析,推导出O-连接糖肽糖链的结构。但对于N-连接糖肽的分析,由于其在线性离子阱质谱上响应较低,进行二级碎裂的时候,由于母离子浓度较小,难以得到有效的糖链碎裂片段。采用傅立叶变换离子回旋共振质谱法(FT-ICRMS),利用CAD技术和电子捕获解离(ECD)技术的互补性,进一步分析了rhEPO-α中O-连接糖基化位点及糖基化结构,成功鉴定了O-连接糖基化结构,并对O-连接糖肽的两种不同价态的ECD断裂方式做了进一步的探讨分析,同时对N-连接糖基化结构进行了初步分析。本研究工作为EPO的检测鉴定提供了一种简单快速的检测方法,同时为糖蛋白中0-连接糖基化位点的研究提供了一种新方法,为开发准确可靠的肽类兴奋剂rhEPO基体检测方法奠定了基础。

全文目录

致谢  5-6
摘要  6-8
ABSTRACT  8-14
第一章综述  14-26
  1.1 促红细胞生成素(Erythropoietin,EPO)  15-17
    1.1.1 EPO的结构特点  16
    1.1.2 重组EPO(rhEPO)  16-17
  1.2 竞技体育中EPO的检测  17-19
    1.2.1 EPO的检测难点  17-18
    1.2.2 EPO的检测方法  18-19
  1.3 傅立叶变换-离子回旋共振质谱法在蛋白质糖基化分析研究中的应用  19-23
    1.3.1 傅立叶变换-离子回旋共振质谱的基本原理及其解离技术  20-22
    1.3.2 傅立叶变换-离子回旋共振质谱在蛋白质糖基化分析中的研究现状  22-23
  1.4 傅立叶变换离子回旋共振质谱法分析EPO糖基化修饰位点的研究优势及意义  23-24
  1.5 研究目标和内容  24-26
    1.5.1 研究目标  24-25
    1.5.2 研究内容  25-26
第二章酶解EPO肽段的液相色谱质谱联用技术分析研究  26-39
  2.1 仪器及试剂  26-27
    2.1.1 实验仪器  26-27
    2.1.2 实验试剂  27
  2.2 rhEPO的酶解  27-28
    2.2.1 酶的选择  27-28
    2.2.2 酶解条件  28
  2.3 rhEPO酶解样品的液相色谱质谱定性分析方法  28-29
    2.3.1 液相条件  29
    2.3.2 质谱条件  29
  2.4 结果与讨论  29-38
    2.4.1 一级质谱分析  29-33
    2.4.2 O-连接糖肽的二级质谱分析  33-35
    2.4.3 N-连接糖肽的二级质谱分析  35-38
  2.5 本章小结  38-39
第三章傅立叶变换-离子回旋共振质谱法对rhEPO中糖基化结构的分析研究  39-59
  3.1 仪器及试剂  39-40
    3.1.1 实验仪器  39-40
    3.1.2 实验试剂  40
  3.2 rhEPO酶解后样品的直接质谱分析  40-42
    3.2.1 酶解后样品的脱盐处理  40
    3.2.2 脱盐后样品的质谱分析  40-42
  3.3 rhEPO酶解后糖肽组分的液相收集  42-44
    3.3.1 液相条件  42
    3.3.2 糖肽组分的收集  42-44
  3.4 N-连接糖肽组分的FT-ICR MS分析  44-49
    3.4.1 N-连接糖肽组分的CAD分析  44-47
    3.4.2 N-连接糖肽组分的ECD分析  47-49
  3.5 O-连接糖肽组分的FT-ICR MS分析  49-58
    3.5.1 O-连接糖肽组分的CAD分析  50-51
    3.5.2 O-连接糖肽组分的ECD分析  51-58
  3.6 本章小结  58-59
第四章结论  59-60
符号说明  60-61
参考文献  61-66
攻读硕士学位期间发表的学术论文  66

促红细胞生成素（EPO）糖基化修饰位点的傅立叶变换离子回旋共振质谱法研究

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