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精子型乳酸脱氢酶LDH-C_4在高原鼠兔体细胞中表达

作　者: 王多伟
导　师: 魏登邦
学　校: 青海大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 高原鼠兔精子特异性乳酸脱氢酶低氧青藏高原
分类号: Q952
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

高原鼠兔（Ochotona curzoniae）是一种生活在青藏高原海拔3000～5000m地区，对低温，低氧有很好耐受性的小型啮齿类土著动物。前期研究表明雌雄高原鼠兔心脏，肝脏，肺，肾脏，大脑，骨骼肌的LDH同工酶谱均显示一致的六条带，并且和睾丸组织的LDH同工酶谱完全一致，我们推测LDH-C4在高原鼠兔体细胞中表达。为了证实LDH-C4在高原鼠兔体细胞中表达，通过分子克隆方法在高原鼠兔体细胞克隆Ldh-a，Ldh-b，Ldh-c的序列；通过Real time PCR检测不同海拔高原鼠兔Ldh-a，Ldh-b，Ldh-c的表达量；通过原核表达系统分离纯化高原鼠兔LDH-C4，结合乳酸脱氢酶同工酶的热稳定性，利用活性染色法确定LDH-C4在高原鼠兔体细胞乳酸脱氢酶同工酶谱中的位置。结果表明：1.高原鼠兔Ldh-a基因全长1693bp，编码区长度为999bp，高原鼠兔Ldh-a的编码区与牛，人，大鼠，小鼠，兔子的同源性分别为87.89%，88.19%，85.69%，86.29%，88.99%和88.49%；高原鼠兔Ldh-b基因全长1299bp编码区长度为1005bp，鼠兔Ldh-b的编码区序列与牛，人，大鼠，小鼠，猩猩的同源性分别为88.46%，90.15%，86.67%，86.47%，90.15%；Ldh-c在高原鼠兔心脏，肝脏，肺，肾脏，大脑中表达，编码区与睾丸中Ldh-c的序列完全一致，高原鼠兔体细胞Ldh-c与Ldh-a，Ldh-b的同源性分别为74%和68%。2.随着海拔高度的增加在高原鼠兔心脏中，Ldh-a， Ldh-b的表达量极显著下降（P<0.01），Ldh-c的表达量下降差异不显著（P>0.05）；随着海拔高度的增加高原鼠兔肝脏中，Ldh-a，Ldh-b的表达量下降差异不显著（P>0.05），Ldh-c的表达量极显著下降（P<0.01）；随着海拔高度的增加高原鼠兔肺中Ldh-a表达量显著下降（P<0.05），Ldh-b，Ldh-c的表达量下降差异不显著（P>0.05）；随着海拔高度的增加高原鼠兔肾脏中Ldh-a的表达量增加差异不显著（P>0.05），Ldh-b表达量下降差异不显著（P>0.05），Ldh-c表达量极显著减少（P<0.01）；随着海拔高度的增加高原鼠兔大脑中Ldh-a（P<0.05）和Ldh-b（P<0.01）的表达量显著降低，Ldh-c表达量下降但差异不显著（P>0.05）；随着海拔高度的增加高原鼠兔骨骼肌中Ldh-a的表达量降低差异不显著（P>0.05），Ldh-b表达量显著下降（P<0.05），Ldh-c表达量极显著减少（P<0.01）；随着海拔高度的增加在高原鼠兔睾丸中，Ldh-a，Ldh-b，Ldh-c的表达量下降但差异不显著（P>0.05）3.成功构建高原鼠兔LDHC原核表达系统，分离纯化得到了具有酶活性的高原鼠兔LDH-C4。4.通过乳酸脱氢酶活性染色法，结合乳酸脱氢酶同工酶的热稳定性，证实高原鼠兔体细胞乳酸同工酶谱中从阴极到阳极的第三条带是LDH-C4。结果表明Ldh-c在高原鼠兔的体细胞中表达，体细胞中LDH-C4的表达可能是高原鼠兔对低氧的一种重要的适应机制。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-9
主要符号对照表  9-10
第一章引言  10-18
  1.1 高原鼠兔及其对高原低氧环境的适应  10-13
    1.1.1 高原鼠兔的生物学特征及其生境特点  10
    1.1.2 高原鼠兔对高原低氧环境的生理适应  10-13
  1.2 精子特异性乳酸脱氢酶  13-18
    1.2.1 LDH-C4的结构和酶学特征  14
    1.2.2 LDH-C4组织定位  14-15
    1.2.3 LDH-C4亚细胞定位  15
    1.2.4 Ldh-c 表达调控  15-16
    1.2.5 LDH-C4的功能  16-18
第二章实验方法  18-26
  2.1 实验材料  18-19
    2.1.1 实验动物  18
    2.1.2 主要试剂  18-19
  2.2 实验方法  19-26
    2.2.1 乳酸脱氢酶同工酶谱  19
    2.2.2 高原鼠兔 Ldh-a，Ldh-b 基因的克隆  19-21
    2.2.3 高原鼠兔体细胞 Ldh-c 基因的扩增  21-22
    2.2.4 Real time PCR  22-23
    2.2.5 LDH-C4原核表达分离纯化  23-26
第三章高原鼠兔 Ldh-a，Ldh-b 基因全长序列及分析  26-30
  3.1 高原鼠兔 Ldh-a 基因序列分析  26-28
  3.2 高原鼠兔 Ldh-b 基因序列分析  28-30
第四章高原鼠兔体细胞中 Ldh-c 基因克隆  30-32
  4.1 RT-PCR 验证 Ldh-c 在高原鼠兔体细胞中表达  30
  4.2 高原鼠兔体细胞 Ldh-c 序列分析  30-31
  4.3 结论  31-32
第五章不同海拔高原鼠兔各组织 Ldh-a，Ldh-b，Ldh-c 的表达量  32-38
  5.1 Real-time PCR 测定 Ldh-c 表达水平  32-34
  5.2 不同海拔高原鼠兔各组织 Ldh-a，Ldh-b，Ldh-c 的相对表达量  34-35
  5.3 结论  35-38
第六章高原鼠兔体细胞 LDH 同工酶谱中 LDH-C4的确定  38-41
  6.1 高原鼠兔乳酸脱氢酶同工酶谱  38
  6.2 LDH-C4的原核表达，分离纯化  38-39
  6.3 高原鼠兔体细胞 LDH 同工酶谱中 LDH-C4位置的确定  39-40
  6.4 结论  40-41
讨论  41-43
全文总结  43-44
参考文献  44-51
致谢  51-52
个人简介  52

精子型乳酸脱氢酶LDH-C_4在高原鼠兔体细胞中表达

内容摘要

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