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一种来源于Enterobacter sp.CGMCC2487菌株的木糖苷酶基因的克隆、异源表达及产物的生化特性研究

作　者: 向海波
导　师: 陈永勤
学　校: 湖北大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 7-木糖-10-去乙酰紫杉醇 10-去乙酰紫杉醇 β-木糖苷酶 基因克隆 异源表达
分类号: Q943.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


紫杉醇为红豆杉植物的次生代谢产物,对卵巢癌、乳腺癌等癌症有很好的治疗作用。目前人们主要从红豆杉的树皮和枝叶中提取紫杉醇。在红豆杉中,紫杉醇的干重仅为0.02%,而10-去乙酰紫杉醇 的学位论文">7-木糖-10-去乙酰紫杉醇的含量则是紫杉醇的10倍以上,但都作为废物而丢弃。7-木糖-10-去乙酰紫杉醇去掉C-7位木糖基即转变为10-去乙酰紫杉醇,再通过一步酰化反应即可生成紫杉醇。因此,利用好这一资源具有广阔的前景。前期实验我们从东北红豆杉中筛选到一株能将7-木糖-10-去乙酰紫杉醇高效水解为10-去乙酰紫杉醇的微生物-Enterobacter sp. CGMCC2487。本实验将用构建基因组文库的方法筛选出Enterobacter sp. CGMCC2487木糖苷酶基因,把筛选到的基因连接到pET-23a载体和pHBM905A载体上,分别转化大肠杆菌和毕赤酵母进行表达。然后用High-Affinity Ni-NTA Resin纯化表达的木糖苷酶,以4-硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷(pNPX)为底物测定木糖苷酶的酶学性质,包括木糖苷酶的酶活、最适温度及温度稳定性、pH及pH稳定性,木糖对酶活的影响,金属离子等一些试剂对酶活的影响等。最后进行7-木糖-10-去乙酰紫杉醇的水解实验,薄层色谱检测水解产物,研究水解效率。通过构建基因组文库,我们筛选到一个木糖苷酶基因,其开放阅读框长1680bp,编码559个氨基酸,编码的木糖苷酶分子量为63.2KDa,等电点为4.90。将该基因重组到E.coli BL21菌株中表达,得到的重组酶的最适pH为6.2,在pH5.0-8.0之间保持稳定。最适温度为50℃,在45-50℃之间保持稳定,酶活力半衰期为1h时的温度T1/2为50℃。该重组酶特异酶活、Km和Vmax分别为618.5mU/mg、2.43±0.0583mmol/L和20.17±0.4834μmol/(min-mg)。该重组酶对木糖比较敏感(抑制常数Ki=24.04mmol/L),其酶活受PMSF,Co2+, Fe3+,Cu2+,Hg2+和Zn2+,SDS的抑制,但2mmol/L的Fe2+能显著提高该酶的酶活,使酶活达到原来的164%。根据该酶对7-木糖-10-去乙酰紫杉醇的水解实验发现该酶不能将7-木糖-10-去乙酰紫杉醇水解为10-去乙酰紫杉醇,推测存在着另外一个能水解7位木糖基的木糖苷酶,目前正在克隆中。

全文目录


摘要  5-6
Abstract  6-10
第一章 综述  10-23
  1.1 紫杉醇  10-11
  1.2 紫杉醇的来源  11-12
    1.2.1 从植物中提取紫杉醇  11
    1.2.2 利用植物细胞产生紫杉醇  11
    1.2.3 真菌发酵法  11-12
    1.2.4 紫杉醇的化学全合成  12
    1.2.5 紫杉醇的半合成  12
  1.3 生物转化在药物生产中的作用  12-14
    1.3.1 生物转化及其优点  12-13
    1.3.2 生物转化在紫杉醇生产中的应用  13-14
  1.4 β-木糖苷酶的研究进展  14-21
    1.4.1 β-木糖苷酶的分类  14-15
    1.4.2 β-木糖苷酶的来源  15
    1.4.3 β-木糖苷酶基因的克隆  15-16
    1.4.4 β-木糖苷酶的酶学性质  16-19
    1.4.5 β-木糖苷酶的结构特点和催化机制  19-20
    1.4.6 β-木糖苷酶的应用前景  20-21
  1.5 本实验相关研究背景  21-23
第二章 材料与方法  23-44
  2.1 实验材料与仪器  23-25
    2.1.1 实验材料  23
    2.1.2 主要试剂  23
    2.1.3 主要仪器与设备  23-24
    2.1.4 培养基  24-25
    2.1.5 主要溶液  25
  2.2 实验方法与步骤  25-44
    2.2.1 菌种活化  25-26
    2.2.2 Enterobacter sp.CGMCC 2487基因组文库的构建  26-29
    2.2.3 木糖苷酶基因的鉴定  29
    2.2.4 木糖苷酶在大肠杆菌(E.coli BL21(DE3)plysS)中的表达  29-34
    2.2.5 木糖苷酶的分离纯化  34-37
    2.2.6 木糖苷酶基因在毕赤酵母中的表达  37-40
    2.2.7 木糖苷酶酶学性质的测定  40-43
    2.2.8 木糖苷酶水解10-去乙酰紫杉醇 的学位论文">7-木糖-10-去乙酰紫杉醇的研究  43-44
第三章 结果与分析  44-64
  3.1 Enterobacter sp.CGMCC 2487基因组文库的构建  44-45
  3.2 木糖苷酶基因的鉴定  45-52
  3.3 Enterobacter sp.CGMCC 2487木糖苷酶基因在大肠杆菌(E.coli BL21(DE3)plysS)中的表达  52-57
    3.3.1 表达载体的构建  52-53
    3.3.2 木糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达及表达条件的优化  53-56
    3.3.3 木糖苷酶的分离纯化  56-57
  3.4 木糖苷酶在毕赤酵母中的表达  57-58
    3.4.1 表达载体的构建  57
    3.4.2 木糖苷酶基因在毕赤酵母中的表达  57-58
  3.5 木糖苷酶的酶学性质  58-63
    3.5.1 酶活的测定  58-60
    3.5.2 酶的最适pH和pH稳定性  60
    3.5.3 酶的最适温度及温度稳定性  60-61
    3.5.4 酶动力学参数的测定和D-木糖对酶活的影响  61-62
    3.5.5 一些试剂对酶活的影响  62-63
  3.6 木糖苷酶对7-木糖-10-去乙酷紫杉醇的水解  63-64
第四章 讨论与展望  64-66
参考文献  66-74
致谢  74

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中图分类: > 生物科学 > 植物学 > 植物细胞遗传学 > 植物基因工程
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