学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

拟南芥ABA诱导侧根减少突变体的筛选与基因克隆

作　者: 常杰
导　师: 宋纯鹏
学　校: 河南大学
专　业: 细胞生物学
关键词: ABA 突变体根系构型信号转导
分类号: Q943.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
下　载: 102次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

侧根作为拟南芥胚后发育的重要器官，在拟南芥根构型建立中起着重要的作用。尽管植物自身营养水平及外界生物、非生物环境条件对侧根的发生都有影响，但是目前对这些因素特别是ABA（脱落酸）影响植物侧根生成的分子机理还知之甚少。因此对ABA调控侧根发育的分子机理研究及关键基因的克隆意义重大。本研究是在设定ABA胁迫条件下对侧根形成和发育相关突变体进行筛选，经过大量的筛选，得到表型比较稳定的与ABA调控根构型有关的突变体4种。本文着重研究了其中1个T-DNA插入突变体，该突变体在ABA胁迫条件下侧根少于野生型（该突变体命名为raa2-1）。通过TAIL-PCR方法，我们得知了RAA2基因的信息，同时我们从salk种子库上查到了该基因的另一个T-DNA插入的突变体材料，并要到了该突变体，命名为raa2-2。通过对突变体表型、遗传分析以及基因克隆和简单的功能分析，我们得到以下主要研究结果:（1）通过对280种T-DNA插入突变体（左建儒实验室惠赠）和40种EMS诱变的突变体（实验室提供），进行在设定ABA胁迫条件下筛选，最终得到表型比较稳定的与ABA调控根构型有关的突变体4种，分别是t237,t245,e28,e45。在MS（含1.2%琼脂）培养基上，这四种突变体的表型都表现为与野生型无明显差异;在含5μMABA的MS（含1.2%琼脂）培养基上,这四种突变体的侧根数量都要比野生型（WT）Columbia（Col-0）的侧根数量少。（2）RAA2功能缺失突变导致在外源5μMABA存在的条件下，突变体侧根的形成受ABA抑制程度更大。用不同种类、不同浓度的糖处理突变体，它们的根系表型与野生型的根系表型则没有明显差异。（3）0.5μM ABA和1μM ABA处理的萌发实验显示，突变体的萌发率比野生型的萌发率低，它们对ABA更敏感。失水和红外实验显示，突变体的气孔开度比野生型的气孔开度大。（4）遗传分析表明，突变体为单基因隐形突变。利用TAIL-PCR方法克隆了RAA2基因。RAA2基因定位在第1条染色体上。对基因进行生物信息学分析得知其所编码的蛋白是一个具有多个跨膜结构域的膜蛋白，该膜蛋白属于LrgB-like家族，且与细菌中的lrgAB操纵子同源，都具有两个保守结构域LrgA和LrgB，目前该膜蛋白功能未知。突变体raa2-1，其T-DNA插入位点位于第二个外显子内。突变体raa2-2，其T-DNA插入位点位于第一个内含子内。（5）对RAA2基因的转录水平进行分析，结果显示两个突变体中RAA2基因均被敲除。同时我们构建了该基因的回补载体和超表达载体，以便进一步了解RAA2基因的功能。综合上述结果，我们认为ABA调控根构型的信号转导过程是非常复杂的信号途径，其作用机制可能与糖信号没有关系。同时发现该基因可能参与ABA调控的其它信号途径。另外，构建RAA2基因的回补载体和超表达载体，为进一步了解RAA2基因的功能做好基础工作。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-11
缩写词  11-12
1 前言  12-24
  1.1 侧根的发育及其相关研究  12
  1.2 ABA 在植物生长发育中的作用  12-19
    1.2.1 ABA 在种子的休眠及萌发中的作用  13
    1.2.2 ABA 在气孔运动中的作用  13-15
    1.2.3 ABA 在侧根发育中的作用  15-19
  1.3 拟南芥 T-DNA 插入突变体  19-21
    1.3.1 XVE 系列载体 pER16 中的 T-DNA 区域  19-20
    1.3.2 拟南芥 T-DNA 插入突变体的基因克隆  20-21
  1.4 基因 RAA2  21-24
2 选题依据及意义  24-26
3 材料和方法  26-36
  3.1 实验材料  26
    3.1.1 植物材料  26
    3.1.2 菌株和质粒载体  26
  3.2 实验试剂  26
  3.3 实验常用溶液  26-27
  3.4 培养基  27
  3.5 实验所用引物  27-28
    3.5.1 纯合突变体鉴定引物  27-28
    3.5.2 TAIL-PCR 所用引物  28
    3.5.3 RT-PCR 所用引物  28
    3.5.4 构建载体所用引物  28
  3.6 实验方法  28-36
    3.6.1 拟南芥的种植  28-29
    3.6.2 突变体的筛选  29
    3.6.3 TAIL-PCR 技术  29-30
    3.6.4 拟南芥的杂交  30
    3.6.5 拟南芥 DNA 的提取  30-31
    3.6.6 拟南芥 T-DNA 插入突变体的纯合体鉴定  31
    3.6.7 总 RNA 的提取和 cDNA 的合成  31-32
    3.6.8 PCR 产物的回收和纯化  32
    3.6.9 ABA 对拟南芥种子萌发的影响  32-33
    3.6.10 拟南芥植株的失水率测定  33
    3.6.11 拟南芥植株的远红外热图分析  33
    3.6.12 重组质粒载体的构建  33-34
    3.6.13 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化  34
    3.6.14 重组质粒的鉴定  34
    3.6.15 农杆菌感受态细胞的制备和转化  34-35
    3.6.16 农杆菌介导的植株的转化  35
    3.6.17 拟南芥转基因植株的筛选  35-36
4 结果与分析  36-50
  4.1 突变体的获得  36
  4.2 突变体 raa2-1 的基因克隆  36-39
    4.2.1 突变体 raa2-1 的 TAIL-PCR 结果  37
    4.2.2 突变体 raa2-1 的序列比对结果  37-38
    4.2.3 基因 RAA2 的生物信息学分析结果  38-39
  4.3 纯合突变体的鉴定  39-40
  4.4 突变体 raa2-1 的遗传学分析  40-41
  4.5 突变体 raa2-1 和 raa2-2 的表型分析  41-47
    4.5.1 ABA 对突变体 raa2-1 和 raa2-2 根系构型的影响  41-42
    4.5.2 ABA 对突变体 raa2-1 和 raa2-2 侧根发育的影响  42-43
    4.5.3 糖对突变体 raa2-1 和 raa2-2 侧根发育的影响  43-44
    4.5.4 ABA 对突变体 raa2-1 和 raa2-2 萌发的影响  44-45
    4.5.5 突变体 raa2-1 和 raa2-2 气孔开度的分析  45-47
  4.6 野生型和突变体 raa2-1、raa2-2 中基因 RAA2 的表达量分析  47-48
  4.7 载体的构建及转基因植株的筛选  48-50
    4.7.1 RAA2::pCAMBIA1300 回补载体的构建及回补植株的筛选  48
    4.7.2 RAA2:: super1300+超表达载体的构建及超表达植株的筛选  48-50
5 讨论  50-52
6 结论  52-54
参考文献  54-62
致谢  62

拟南芥ABA诱导侧根减少突变体的筛选与基因克隆

内容摘要

全文目录

相似论文