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弯曲杆菌对大环内酯类的耐药发生与适应性研究

作　者: 郝海红
导　师: 袁宗辉
学　校: 华中农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 空肠弯曲杆菌大环内酯类药物耐药性产生适应性实时荧光定量PCR 基因芯片
分类号: R378
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

弯曲杆菌(Campylobacter),尤其是空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)是一种非常重要的食源性致病菌。氟喹诺酮类和大环内酯类药物是治疗弯曲杆菌感染的首选药物。由于弯曲杆菌对氟喹诺酮类药物的耐药问题日益严重,大环内酯类药物对弯曲杆菌的治疗就显得尤为重要。作为世界第三大类药物,大环内酯类药物,尤其是泰乐菌素(动物饲料添加剂)和红霉素(治疗用药)被广泛用于兽医和人医临床。目前,一些流行病学调查数据显示,弯曲杆菌对大环内酯类药物的耐药率呈现上升趋势,若不加以防范,就有可能使人弯曲杆菌病的治疗陷入无药可用的境地。因此控制大环内酯耐药弯曲杆菌的产生、扩散和流行势在必行。为从源头上控制耐药菌的产生,我们必须研究弯曲杆菌大环内酯耐药性的产生规律和机制；为有效控制耐药菌的扩散和流行,我们必须研究耐药菌的适应性及其机制,因为耐药菌的适应性是决定其在环境中扩散和流行的基本因素。鉴于高水平大环内酯耐药弯曲杆菌的危害性,本研究首先建立了一种基于TaqMan探针的实时荧光定量PCR方法,用于特异性鉴别和定量分析弯曲杆菌23SrRNA基因突变,并对临床菌的耐药突变进行了初步调查；然后用固定浓度的泰乐菌素对两株大环内酯敏感菌(C.jejuni ATCC33291和H1)进行体外诱导,获得了含有23S rRNA突变的高水平耐药菌,并考察了其体外适应性的变化情况。鉴于高水平大环内酯耐药弯曲杆菌的产生需要一个漫长的过程,为揭示其耐药性产生和适应性变化的规律和分子机制,本研究又用升浓度的红霉素和泰乐菌素对两株敏感菌(C.jejuni NCTC11168和81-176)进行了体外逐步诱导试验,对其间获得的耐药菌的表型(MIC)和基因型(23S rRNA、核糖体L4和L22突变)进行监测,并选取2种不同来源的6株低中高水平耐药菌分别进行了适应性分析；最后应用基因芯片等技术系统考察了这6株低中高水平耐药菌相对于母体敏感菌的基因表达差异,并用生物信息学手段对差异基因进行了全面地分析。1.实时荧光定量PCR方法检测弯曲杆菌大环内酯耐药突变点据报道,弯曲杆菌23S rRNA基因上A2075G和A2074C突变是主要的大环内酯耐药突变,且突变点的数量可能与耐药水平相关。鉴于此,本研究建立了一种基于TaqMan探针的real-time PCR新方法,用于特异性鉴别和定量检测弯曲杆菌23SrRNA基因上的这两种大环内酯耐药相关突变。本试验首先根据弯曲杆菌23S rRNA序列和突变类型(野生型、A2074C突变型和A2075G突变型),设计特异性引物和TaqMan探针,并对real-time PCR反应条件和反应体系进行优化；然后构建三种标准质粒(野生型质粒、含有A2074C位点突变的质粒和含有A2075G位点突变的质粒)；再对所建立的TaqMan real-time PCR方法的特异性、灵敏性和准确性进行相应的考查；最后应用所建立方法对临床分离菌的23S rRNA基因突变进行筛查。结果显示所建方法能够准确地鉴别野生型、A2074C突变和A2075G突变质粒,特异性好。新方法的线性范围较宽,可以检测10-106拷贝的耐药突变点,其标准曲线的相关系数达0.99,可用于定量。应用此方法检测已知浓度和比例的质粒样品,检测结果和实际值相吻合,灵敏度较高。应用此方法检测临床分离弯曲杆菌,检测结果与测序结果100%吻合,准确性很好。综上所述,与以往的定性检测方法相比,新方法可以快速、灵敏、准确地定量检测弯曲杆菌23S rRNA基因突变。对16株临床分离耐药弯曲杆菌的调查结果显示,8株高水平耐药菌(EryMIC＞128μg/ml)中都只含有三个拷贝的A2075G突变,而8株低中水平耐药菌(EryMIC=16-64μg/ml)中不含23S rRNA突变,其耐药性可能由其他机制介导。2.高水平大环内酯耐药弯曲杆菌的体外获取和适应性分析为获得含有23S rRNA突变的高水平大环内酯耐药弯曲杆菌并研究其相对适应性,本实验选取了两株来源于不同地域的大环内酯敏感菌(C.jejuni ATCC33291和H1),使用16μg/ml的泰乐菌素对其进行体外诱导。在诱导过程中,监测耐药菌的MIC表型变化；在诱导结束后,对所获得的高水平耐药菌进行DNA测序(检测23SrRNA、核糖体蛋白L4和L22上的耐药相关突变),并选取其中几株有代表性的高水平耐药突变菌进行体外适应性分析。结果显示,高水平大环内酯耐药弯曲杆菌的获得需要一个漫长的过程。不同于在多数临床菌中所发现的23S rRNAA2075G突变,本实验体外诱导所获得的高水平耐药菌大都在三个拷贝的23S rRNA上携带A2074C突变,此突变可以在不含药物的培养条件下长期稳定存在。然而体外适应性分析结果显示,含有A2074C突变的耐药菌具有一定的适应性代价,在无药存在的环境中,突变菌可能逐渐被敏感菌取代。3.大环内酯耐药弯曲杆菌的逐步产生过程及其适应性变化为充分理解大环内酯耐药弯曲杆菌的逐步产生过程及其适应性变化规律,本实验选取了两株已知基因组背景的空肠弯曲杆菌敏感菌(C. jejuni NCTC11168和81-176)作为母体菌,用逐步升浓度红霉素和泰乐菌素对其进行长期的体外诱导,其间适时地监测所有诱导菌的耐药表型(MIC)和靶基因(包括23S rRNA,核糖体蛋白L4和L22)突变情况,最后从C.jejuni NCTC11168和81-176诱导菌中各选取一个系列(含低中高水平耐药菌)进行体外适应性分析。结果证实23S rRNA基因突变的产生需要漫长的过程。23S rRNA A2074C突变仍然是体外诱导菌中的主要突变类型,且A2074C突变的拷贝数可能与耐药水平相关。在一株诱导菌中,我们首次发现了23S rRNA C2627A突变,其可能与弯曲杆菌高水平大环内酯耐药相关。在不同水平耐药菌的核糖体蛋白L4和L22上,我们发现了多个新的位点突变,其中某些L4和L22突变可能有利于23S rRNA基因突变的产生,而有些则可能抑制23S rRNA突变的产生。对源于C.jejuni NCTC11168的68E3系列耐药菌(低水平耐药菌68E3-1、中水平耐药菌68E3-8和含三个拷贝23SrRNA A2074C突变的高水平耐药菌68E3-64)和源于C.jejuni 81-176的76E6系列耐药菌(中水平耐药菌76E6-2、含两个拷贝23S rRNA A2074C突变的高水平耐药菌76E6-8和含三个拷贝23S rRNA A2074C突变的高水平耐药菌76E6-64)的体外适应性分析结果显示：68E3系列耐药菌(68E3-8和68E3-64)的体外相对适应性值都低于1,具有显著的适应性代价,尤其是68E3-8的生长力较其母体菌C. jejuni NCTC11168显著下降；而76E6系列耐药菌(76E6-2、76E6-8和76E6-64)的体外相对适应性值略大于1,没有表现适应性代价。4.大环内酯耐药空肠弯曲杆菌的基因表达差异分析为深入研究空肠弯曲杆菌的耐药性产生和适应性变化的分子机制,68E3系列中的株菌(C.jejuni NCTC11168、68E3-1、68E3-8和68E3-64)和76E6系列中的四株菌(C.jejuni 81-176、76E6-2、76E6-8和76E6-64)被选取用于基因芯片分析,考察低中高水平耐药菌相对其母体敏感菌的基因表达差异,并对差异基因进行功能分类、聚类分析和蛋白质网络分析。在68E3和76E6系列耐药菌中分别出现了265个和145个差异基因。这些差异基因的数量和差异倍数呈现一定的动态变化规律：低水平耐药菌中的差异基因数量最少,差异幅度最小；不含23S rRNA突变的中水平耐药菌中的差异基因数量最多,差异幅度最大；当弯曲杆菌获得三个拷贝23S rRNAA2074C突变后,其差异基因的数量和差异幅度又有所下降。在68E3系列中,大量的核糖体蛋白(rpsCEF, rplCDEMW, rpmC)、转运体(livHJG, modBC)和外输泵蛋白(Cj1173, cmeBC, Cj0035c)在中水平耐药菌68E3-8中过量表达。而一些广义转录调控基因(Cj0448c,Cj1491c)、能量代谢基因(pyk,sdhABC,acnB, frdABC)、呼吸相关基因(gpsA, napAGH,atpB)、核心物质代谢基因(ppa, gltB, aspA)、氨基酸合成基因(glnA, argG, serA, aroQ, leuB)、脂质蛋白/膜蛋白(pal/ompl8, porA)、细胞表面结构鞭毛基因(flgBCGG2EE2KI, fliDE, flaBCD)、转运结合蛋白基因(peb1A, chuAD, dcuA, corA, cfrA, lctP,exbB2D2)和热休克蛋白基因(clpB, cbpA, groESL, grpE,dnaK)在68E3-8中的表达量下降。在76E6系列中,广义转录调控基因(rpoD)基因、核糖体蛋白(rpmAB)、外输泵蛋白(cmeAC)、鞭毛蛋白(flgBCDGI, flaDGG2)和热休克蛋白(clpB, grpE, groESEL, dnaJ)在耐药菌中的表达量上升。而一些小分子物质代谢基因(sdhA, sucD, gltA, mdh, ackA, atpC,ackA, aspA, trpF,aroE, leuBC, purQ, acs, fabD)和转运结合蛋白(sdaC, pebA,lctP, dcuA, dctA)在耐药菌中的表达量下降。综合68E3和76E6系列中表达模式相同的差异基因,我们发现核糖体蛋白、外输泵蛋白CmeABC和其他基因(Cj0440c,Cj1199和Cj0239c)在两个系列耐药菌的表达量上升,而广义调控蛋白(Cj0448c)、能量代谢基因和膜/脂质蛋白(pal)的表达量下降。核糖体蛋白的过量表达可能改变一些特殊蛋白质的翻译,导致细菌耐药。而Cj0440c,Cj1199和Cj0239c的表达可能与大环内酯类抗性多肽的合成相关。综合68E3和76E6系列中表达模式相反的差异基因,我们发现鞭毛蛋白、热休克相关蛋白和少量能量代谢基因在68E3系列耐药菌的表达量下降,在76E6系列耐药菌的表达量上升。这些基因的过量表达可能帮助76E6系列耐药菌提高其自身适应性,而其表达量下降则可能是68E3系列耐药菌表现出显著的适应性代价的原因。综上所述,本课题以研究弯曲杆菌对大环内酯类药物的耐药性和适应性为主旨,首次建立了一种实时荧光定量PCR方法用以定量检测弯曲杆菌23S rRNA基因上的大环内酯耐药相关突变点,为筛查和监控高水平大环内酯耐药弯曲杆菌提供了有利的工具；首次通过固定浓度诱导方法获得了23S rRNAA2074C突变菌,并通过适应性分析发现此高水平大环内酯耐药突变菌具有一定的适应性代价；首次在升浓度药物诱导过程中,监测了23S rRNA和核糖体L4/L22基因突变的产生规律及相互关系,并系统比较了低中高水平耐药菌的适应性变化规律；首次应用基因芯片等分子生物学方法,获得了低中高水平耐药菌的转录谱,并通过生物信息学手段对差异基因进行了深入细致的分析,由此探讨了弯曲杆菌对大环内酯类药物的耐药性和适应性的变化规律和分子机制,并比较了种属差异对于其耐药性产生和适应性变化的影响。因此,本课题研究成果为有效控制大环内酯类耐药弯曲杆菌的产生和流行提供了较为先进的检测手段和相对全面而系统的理论基础。

全文目录

目录  5-9
摘要  9-14
Abstract  14-20
缩略语表  20-22
1 前言  22-30
  1.1 立题依据  22-24
  1.2 弯曲杆菌大环内酯耐药性和适应性研究进展  24-28
  1.3 研究内容和目标  28-30
2 实时荧光定量PCR方法检测弯曲杆菌大环内酯耐药突变  30-44
  2.1 引言  30-31
  2.2 材料方法  31-37
    2.2.1 药品与试剂  31
    2.2.2 主要仪器设备  31-32
    2.2.3 菌株、培养基和培养条件  32-33
    2.2.4 弯曲杆菌的药物敏感性测定  33
    2.2.5 细菌基因组提取  33-34
    2.2.6 弯曲杆菌耐药相关突变点的测序鉴定  34
    2.2.7 标准质粒的构建与确证  34-36
    2.2.8 TaqMan real-time PCR方法的建立  36
    2.2.9 TaqMan real-time PCR的特异性考查  36-37
    2.2.10 TaqMan real-time PCR的灵敏性考查  37
    2.2.11 弯曲杆菌分离株的突变分析  37
  2.3 结果  37-42
    2.3.1 标准质粒的序列确证  37-38
    2.3.2 TaqMan real-time PCR的特异性  38-40
    2.3.3 TaqMan real-time PCR的灵敏性  40-42
    2.3.4 弯曲杆菌分离株的耐药突变特性  42
  2.4 讨论  42-44
3 高水平大环内酯耐药弯曲杆菌的体外获取和适应性分析  44-56
  3.1 引言  44
  3.2 材料方法  44-47
    3.2.1 药物  44-45
    3.2.2 主要仪器设备  45
    3.2.3 菌种和培养条件  45
    3.2.4 弯曲杆菌对泰乐菌素的MIC、MPC和MSW的测定  45
    3.2.5 固定浓度诱导实验和稳定性考察  45-46
    3.2.6 耐药相关突变分析  46
    3.2.7 耐药菌体外适应性分析  46-47
  3.3 结果  47-53
    3.3.1 两株敏感菌对泰乐菌素的MIC、MPC和MSW值  47
    3.3.2 体外诱导耐药菌的表型和基因突变类型  47-51
    3.3.3 高水平耐药菌的体外相对适应性  51-53
  3.4 讨论  53-56
4 大环内酯耐药弯曲杆菌的逐步产生过程及其适应性变化  56-72
  4.1 引言  56
  4.2 材料方法  56-59
    4.2.1 药物  56
    4.2.2 主要仪器设备  56-57
    4.2.3 菌种和培养条件  57
    4.2.4 弯曲杆菌对红霉素和泰乐菌素的MIC、MPC和MSW的测定  57
    4.2.5 体外诱导实验  57
    4.2.6 耐药相关突变分析  57-58
    4.2.7 耐药菌体外适应性分析  58-59
  4.3 结果  59-68
    4.3.1 两株敏感菌对红霉素和泰乐菌素的MIC、MPC和MSW值  59
    4.3.2 体外诱导过程中耐药菌的MIC和靶基因突变类型  59-65
    4.3.3 耐药菌的体外相对适应性结果  65-68
  4.4 讨论  68-72
5 大环内酯耐药空肠弯曲杆菌的基因表达差异分析  72-140
  5.1 引言  72-73
  5.2 材料方法  73-82
    5.2.1 实验相关试剂  73-75
    5.2.2 主要仪器设备  75
    5.2.3 菌株和背景  75-76
    5.2.4 细菌总RNA提取和纯化  76-77
    5.2.5 差异表达基因的检测(基因芯片)  77-79
    5.2.6 差异表达基因的数据分析(基因芯片)  79-81
    5.2.7 部分差异基因的确证(Real-time RT-PCR、Western-blot)  81-82
  5.3 结果  82-134
    5.3.1 细菌总RNA的质量和纯度鉴定  82-84
    5.3.2 基因芯片的质量和数据处理的可靠性  84-85
    5.3.3 68E3系列中耐药菌的基因表达差异  85-105
    5.3.4 76E6系列中耐药菌的基因表达差异  105-126
    5.3.5 68E3和76E6系列中差异基因的比较分析  126-134
  5.4 讨论  134-140
    5.4.1 弯曲杆菌对大环内酯类药物的耐药新机制  135-137
    5.4.2 弯曲杆菌大环内酯类耐药相关适应性机制  137-140
6 全文创新性总结  140-142
7 弯曲杆菌对抗生素耐药性和适应性研究进展(综述)  142-164
  7.1 弯曲杆菌对重要抗生素的耐药性流行情况  142-144
  7.2 弯曲杆菌对重要抗生素的耐药性产生和耐药机制  144-157
    7.2.1 弯曲杆菌对氟喹诺酮类药物的耐药性产生和耐药机制  144-148
    7.2.2 弯曲杆菌对大环内酯类药物的耐药性产生和耐药机制  148-150
    7.2.3 弯曲杆菌对四环素类药物的耐药性产生和耐药机制  150-152
    7.2.4 弯曲杆菌的多重耐药机制  152-157
  7.3 耐药弯曲杆菌的适应性研究  157-162
    7.3.1 氟喹诺酮类耐药弯曲杆菌的适应性  158-159
    7.3.2 大环内酯类耐药弯曲杆菌的适应性  159-161
    7.3.3 四环素类耐药弯曲杆菌的适应性  161-162
  7.4 结论  162-164
参考文献  164-182
致谢  182-183
作者简介  183-185
答辩主要问题及回答  185-189

弯曲杆菌对大环内酯类的耐药发生与适应性研究

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