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鸡传染性支气管炎病毒生产用种毒的分子生物学鉴定方法的研究

作　者: 于静
导　师: 夏业才
学　校: 中国兽医药品监察所
专　业: 预防兽医学
关键词: 鸡传染性支气管炎病毒 分子生物学鉴别方法 疫苗 序列分析
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


鸡传染性支气管炎(Avian Infectious Bronchitis,IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(Avian Infectious Bronchitis Virus,IBV)引起的一种急性、高度接触传染性疾病,其临床特征为病鸡咳嗽、喷嚏、气管啰音；幼鸡流鼻液；蛋鸡产蛋数量和品质下降,是严重危害养禽业的主要传染病之一。疫苗免疫是当前预防和控制鸡传染性支气管炎的主要措施,针对不同致病型或血清型的病毒,国内外均有多种疫苗毒株和疫苗效力评价用强毒株。一些毒株用传统的种毒鉴定方法很难准确鉴别,尤其是血清型相同的毒株,因此有必要建立分子生物学鉴别方法,进一步完善IBV特异性检验方法,从而对IBV种毒进行鉴定,并对国内外疫苗进行纯净性检测。本研究以中国兽医药品监察所菌种中心保存的不同年代的32株H120株、H52株和M41株种毒为研究对象,采用自行设计的特异性引物经RT-PCR技术扩增得到病毒的S1蛋白基因片段。经过序列分析,种毒H52中,1993年3月25日与1993年3月28日冻干的H52种毒的S1基因序列与其他代次不同,但与M41株一致。查阅种毒原始记录,该批次种毒检定不合格,安全检验表明接种该批次H52病毒的鸡出现了呼吸啰音、甩头等症状。1983年10月7日和1992年12月冻干的种毒与其他几株相比,分别存在2个和9个核苷酸突变。H120种毒中未发现明显碱基变异。M41株可分成两组：79年、88年、91年、96年、93年4月、01年冻干的种毒序列一致；而76年、93年3月、06年冻干的种毒序列一致,与H120相似。将从GenBank上下载的H52株、H120株、M41株以及欧洲使用的疫苗4/91株的全基因序列(全长27.6kb)进行比对分析,从中找出他们之间序列差异较明显的区域,使用自行设计的四对引物(引物对A、引物对B、引物对C、引物对D)对这四种毒株进行扩增。用引物对A时,能扩增出M41株全基因组序列中2900-4690bp处长度为1791bp的目的片断,所需的M41株最低病毒滴度为103.5EID50/mL,而无法扩增出H52株和H120株,因此用该对特异性引物能够区分M41株与H52株、H120株。用引物对B时,能够扩增出H52株和H120株全基因组序列中21588bp-23288bp处长度为1700bp的目的片断,所需的H120(H52)株最低病毒滴度为1035EID50/mL,再利用限制性内切酶Nae Ⅰ对PCR纯化产物进行酶切,H120株能够被切成1000bp和700bp两个片断,而H52株的扩增产物由于不存在该酶切位点,所以无法切开。因此利用特异性引物对B并结合酶切的方法可以区分H52株和H120株。使用引物对C时,能够扩增出4/91毒株S1基因序列中长度为1351bp的目的片断,所需的4/91株最低病毒滴度为1025EID50/mL,并结合使用引物对D进行套式PCR就能扩增出4/91株Sl基因中1066bp的目的片断,而无法扩增H52株、H120株和M41株,因此使用引物对C和引物对D能够有效区分4/91疫苗株和H52株、H120株、M41株,三对引物A、B、C均具有很好的特异性。从全国疫苗企业中随机抽取了19个疫苗企业共75批IBV活疫苗、从市场上抽取了11个企业的共16批IBV活疫苗、从5个外国企业(中国代理)中共抽取了15批IBV活疫苗,对其进行S1基因测序并使用上述建立的分了牛物学鉴别方法进行检测。结果显示：H120株疫苗和H52株疫苗用引物对B进行检测时,结果符合率为100%,用引物对C和引物对D检测发现,国内禽苗企业的75批疫苗中有6个企业9批疫苗、市场上抽取的16批禽疫苗中有1批疫苗出现了4/91株特异性片段,而从外企抽取的活疫苗均未出现4/91株特异性片段。综上所述,木研究通过对中国兽医药品监察所菌种中心保存的1BV种毒株的主要免疫原性基因Sl基因进行测序分析,并对IBV的H52株、H120株、M41株及国外流行疫苗毒株4/91株的全基因组进行分析,建立的鸡传染性支气管炎病毒种毒的分子生物学鉴别方法,进一步完善了种毒特异性检验方法。并将该方法应用于国内外市场中的鸡传染性支气管炎病毒活疫苗的纯净性检测,为今后IBV疫苗种毒、疫苗鉴别检验技术支撑。

全文目录


摘要  4-6
ABSTRACT  6-11
插图与附表清单  11-13
缩略语中英文对照表  13-14
第一章 引言  14-27
  1.1 国内外研究现状  14-24
    1.1.1 鸡传染性支气管炎流行病学研究概况  14-15
    1.1.2 鸡传染性支气管炎病毒病原学特点  15-20
    1.1.3 IBV各毒株的鉴定方法  20-22
    1.1.4 鸡传染性支气管炎的免疫机理  22-24
    1.1.5 国内外IBV疫苗研究进展  24
  1.2 研究内容与技术路线  24-26
    1.2.1 研究内容  24-25
    1.2.2 技术路线  25-26
  1.3 研究目的和意义  26-27
第二章 鸡传染性支气管炎病毒种毒的S1基因变异情况分析  27-45
  2.1 试验材料  27-31
    2.1.1 毒株  27-30
    2.1.2 鸡胚  30
    2.1.3 主要试剂及其配制方法  30-31
    2.1.4 主要仪器设备  31
    2.1.5 试验用材料  31
  2.2 试验方法  31-33
    2.2.1 病毒的繁殖  31
    2.2.2 引物设计  31-32
    2.2.3 病毒RNA的提取  32
    2.2.4 病毒S1基因的扩增  32
    2.2.5 PCR产物鉴定及纯化回收  32-33
    2.2.6 S1基因序列的测定、比对、分析序列差异  33
    2.2.7 S1基因序列的分析、比较  33
  2.3 试验结果  33-43
    2.3.1 IBV各个种毒株S1基因的扩增结果  33-35
    2.3.2 IBV S1基因序列比较及不同毒株间序列差异分析  35-37
    2.3.3 不同基因型IBV毒株在S1基因部分碱基差异  37-43
  2.4 讨论与小结  43-45
    2.4.1 IBV毒株特异性鉴定  43
    2.4.2 IBV种毒株S1基因序列分析  43-45
第三章 IBV毒株分子生物学鉴别方法的研究  45-57
  3.1 试验材料  45-47
    3.1.1 毒株  45-46
    3.1.2 鸡胚  46
    3.1.3 主要酶与试剂  46
    3.1.4 主要仪器设备  46-47
  3.2 试验方法  47-51
    3.2.1 病毒RNA的提取  47
    3.2.2 参考序列下载  47
    3.2.3 引物的设计  47-49
    3.2.4 反转录及PCR  49
    3.2.5 PCR产物凝胶电泳及电泳图谱拍照  49
    3.2.6 PCR产物纯化  49-50
    3.2.7 引物对B(NaeⅠ(+)、Nae Ⅰ(-))的PCR纯化产物的酶切  50
    3.2.8 引物特异性鉴定  50
    3.2.9 引物敏感性鉴定  50-51
    3.2.10 建立的分子生物学鉴定方法的验证  51
  3.3 结果  51-55
    3.3.1 引物对A的PCR扩增产物检测结果  51
    3.3.2 引物对B的PCR扩增产物检测结果  51-52
    3.3.3 引物对B扩增的PCR产物酶切结果  52
    3.3.4 引物对C扩增的PCR产物检测结果  52
    3.3.5 引物的特异性鉴定  52-53
    3.3.6 引物的敏感性鉴定  53-55
  3.4 讨论与小结  55-57
    3.4.1 IBV不同基因型之间的分子生物学鉴别方法  55-56
    3.4.2 引物特异性及敏感性分析  56
    3.4.3 建立的分子生物学鉴定方法的验证分析  56-57
第四章 分子生物学鉴别方法的市场应用  57-65
  4.1 试验材料  57-58
    4.1.1 IBV疫苗  57
    4.1.2 主要酶与试剂  57-58
    4.1.3 主要仪器设备  58
  4.2 试验方法  58-61
    4.2.1 病毒RNA的提取  58
    4.2.2 反转录及PCR  58-59
    4.2.3 PCR产物凝胶电泳及电泳图谱拍照  59
    4.2.4 PCR产物纯化  59
    4.2.5 引物对B(Nae Ⅰ(+)、Nae Ⅰ(-))的PCR纯化产物的酶切  59-60
    4.2.6 IBV活疫苗样品  60-61
  4.3 结果  61-63
    4.3.1 特异性引物对疫苗的检测结果  62
    4.3.2 引物对C和引物对D经巢式PCR扩增出的4/91毒株的序列  62-63
  4.4 讨论与小结  63-65
第五章 结论  65-66
  5.1 主要结论  65
  5.2 创新点  65
  5.3 有待进一步解决的问题  65-66
参考文献  66-71
致谢  71-72
作者简历  72

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 家畜病毒学
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