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粤蓝链霉菌中丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因gra-orf7功能初探

作　者: 李超
导　师: 胡建伟; 朱红惠
学　校: 塔里木大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 粤蓝链霉菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶榴菌素 gra-orf7基因
分类号: Q93
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

链霉菌中存在丰富的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Serine/Threonine protein kinase,STPK),在ATP等磷酸供体的存在下,能够特异地使底物蛋白中丝氨酸/苏氨酸残基上的羟基磷酸化而激活底物蛋白,导致蛋白活性、性质的改变,从而参与其生长、发育分化及次级代谢等多种重要的生命活动过程。对其功能研究将为我们深入了解链霉菌的生命活动规律提供帮助。粤蓝链霉菌(Streptomyces vietnamensis)GIMV4.0001广东省微生物研究所,广东省菌种保藏与应用重点实验室近期从热带原始森林土壤中分离获得的一株能够产榴菌素的链霉菌新种。前期研究发现在其榴菌素生物合成基因簇的左翼存在一个可能的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因gra-orf7。为了解该基因在粤蓝链霉菌中的生理功能,本研究采用PCR-targeting系统成功地构建了粤蓝链霉菌gra-orf7基因缺失突变株。对粤蓝链霉菌gra-orf7基因缺失突变株的表型分析结果显示,突变株在菌落形态、产孢能力、孢子形态以及色素(榴菌素)最终产率等方面与野生株均无显著差异,但是产色(榴菌素)时间延迟约1h。表明gra-orf7基因在粤蓝链霉菌的发育分化和榴菌素的生物合成过程中并不扮演重要角色,但是突变株的产色延迟现象与gra-orf7基因的失活直接相关。从而揭示gra-orf7基因在粤蓝链霉菌中具有一定的生物学功能,可能参与了与榴菌素生物合成有关的上游调控信号的传导,也可能是gra-orf7基因的目标蛋白被其它未知STPK激活,形成某种补偿机制。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-9
缩写词及主要符号表  9-11
第一章前言  11-27
  1.1 链霉菌及其产生的活性次级代谢产物  11-13
    1.1.1 链霉菌简介  11-13
  1.2 聚酮合酶途径  13-16
    1.2.1 Ⅰ型PKS  13-14
    1.2.2 Ⅱ型PKS  14-15
    1.2.3 Ⅲ型PKS  15-16
  1.3 抗生素生物合成的调控  16-18
    1.3.1 途径特异性调控  16-17
    1.3.2 全局性调控  17-18
    1.3.3 交互调控  18
  1.4 链霉菌中双组份调控系统与丝氨酸苏氨酸蛋白激酶  18-21
    1.4.1 链霉菌中双组份调控系统  18-19
    1.4.2 链霉菌中丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶  19-21
  1.5 粤蓝链霉菌和榴菌素  21-25
    1.5.1 粤蓝链霉菌  21
    1.5.2 榴菌素  21-25
  1.6 本研究的目的及意义  25
  1.7 技术路线  25-27
第二章敲除质粒PCR-ORF7UD的构建  27-37
  2.1 引言  27
  2.2 实验设备和材料  27-29
    2.2.1 主要仪器  27
    2.2.2 试验菌株  27
    2.2.3 主要试剂  27-28
    2.2.4 溶液和培养基配方  28-29
  2.3 实验方法  29-34
    2.3.1 链霉菌旳培养和保存  29
    2.3.2 链霉菌孢子悬液的制备  29
    2.3.3 链霉菌基因组DNA提取  29-31
    2.3.4 大肠杆菌感受态细胞的制备  31
    2.3.5 DNA的连接  31
    2.3.6 重组质粒的转化及筛选  31-32
    2.3.7 大肠杆菌质粒的提取  32-33
    2.3.8 引物设计及PCR扩增  33-34
    2.3.9 重组质粒的鉴定  34
    2.3.10 序列测定和分析  34
  2.4 结果与分析  34-36
    2.4.1 gra-orf7基因下游序列的克隆与测序  34-35
    2.4.2 重组质粒pCR-orf7UD的构建  35-36
  2.5 结论与讨论  36-37
第三章粤蓝链霉菌gra-orf7基因缺失突变株的构建  37-44
  3.1 引言  37
  3.2 实验设备和材料  37-39
    3.2.1 主要仪器  37
    3.2.2 试验菌株  37-38
    3.2.3 主要试剂  38
    3.2.4 溶液和培养基配方  38-39
  3.3 实验方法  39-42
    3.3.1 引物设计  39-40
    3.3.2 PCR-targeting系统在粤蓝链霉菌中的应用  40
    3.3.3 PCR-targeting系统中的大肠杆菌电转化感受态制备及电转化  40-41
    3.3.4 质粒从大肠杆菌向链霉菌的接合转移  41-42
    3.3.5 接合转移子的筛选与鉴定  42
  3.4 结果与分析  42-43
    3.4.1 突变株的构建  42
    3.4.2 突变株的基因型验证  42-43
  3.5 结论与讨论  43-44
第四章粤蓝链霉菌gra-orf7基因缺失突变株的表型分析  44-49
  4.1 引言  44
  4.2 实验设备与材料  44-45
    4.2.1 主要仪器  44
    4.2.2 试验菌株  44
    4.2.3 主要试剂  44
    4.2.4 溶液和培养基配方  44-45
  4.3 实验方法  45
    4.3.1 突变株菌落形态分析  45
    4.3.2 突变株孢子微观形态分析  45
    4.3.3 突变株产色(榴菌素)能力分析  45
  4.4 结果与分析  45-47
    4.4.1 突变株菌落形态分析  45-46
    4.4.2 突变株孢子微观形态分析  46
    4.4.3 突变株产色(榴菌素)能力分析  46-47
  4.5 结论与讨论  47-49
第五章结论  49-50
参考文献  50-56
附录  56-62
致谢  62-63
个人简历  63

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