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转基因棉籽及其食用油脂多重PCR检测的研究

作　者: 刘东
导　师: 崔建东; 朱俊萍
学　校: 河北科技大学
专　业: 生物工程
关键词: 转基因棉籽油脂 DNA提取多重PCR 检测
分类号: S562
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
下　载: 15次
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内容摘要

随着我国转基因棉花种植面积的扩大和种植比例不断的提高,由转基因棉籽加工而成的转基因棉籽油已经在人们不知不觉中走进了餐桌,这也导致外源DNA以及由外源DNA编码产生的新的外源蛋白进入了人们的体内,相比较经过人类几千年食用证明是安全的非转基因棉籽加工而成的棉籽油,转基因棉籽油的安全性问题就成为摆在人类面前的重大难题,也是急需解决的问题。虽然转基因食品的安全性,转基因棉籽油的安全性均没有定论,但是,在不能确定转基因棉籽油安全性的前提下,保证消费者的知情权就是十分必要的了,市场上存在转基因棉籽油未标签标注、转基因与非转基因棉籽混贮、混合加工等情况,因此,不论是对转基因棉籽油帖示标签,或是对转基因与非转基因棉籽进行分别贮藏运输和分别加工,转基因棉籽和转基因棉籽油的检验都是必不可少的。因此,建立一种能有快速、高效、准确的检测转基因棉籽及其加工制品——棉籽油的方法是亟待解决的问题。本研究所要建立的多重PCR检测体系可以完成转基因棉籽及转基因棉籽油的检测工作,以转基因棉花中常见的插入基因35S启动子(Cauliflowermosaicvirus35S, CaMV35S)、Nos终止子(Nopalinesynthase, Nos)、GUS、CrylAc四种外源基因和棉籽内源基因植物叶绿体tRNALeu基因为检测的目的片段,建立了从棉籽和棉籽食用油脂中提取基因组DNA和消除多重PCR反应抑制因子的方法。满足了转基因棉籽一个内源基因和四个外源基因的同步检测,检测了已知转基因棉籽、市售棉籽和转基因食用油脂,确定了检出限为0.5%。多重PCR反应体系为：94-C预变性5min,再94℃1min-56.7℃30s-72℃1min反应时长35个循环,最后72℃延伸5min。PCR反应体系50μL,组成成分为：4μLdNTPs混合物,5μL1O×PCR buffer,0.5μL10pmol正向引物(五种引物各0.5μL),0.5μL10pmol反向引物(五种引物各0.5μL),1μL(5U/μL)Taq,提取模板各1μL,用灭菌的双蒸水补足50μL。通过2%的琼脂糖凝胶电泳,同时利用凝胶成像系统观察电泳结果。对每个单一产物进行测序比对,结果显示四种棉籽外源基因(GUS、 CrylAc、CaMV35S、Nos终止子)和一种棉籽内源基因(植物叶绿体tRNALeu)的PCR扩增产物基因序列的同源性均为100%,最终证实PCR扩增产物的正确性。通过本研究可以说明,多重PCR检测转基因棉籽及其食用油脂一种高效、准确的方法,具有很好的应用前景和十分有益的社会效益。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-8
第1章绪论  8-19
  1.1 研究的背景和意义  8-10
  1.2 我国转基因棉花的发展现状及趋势  10-11
    1.2.1 我国转基因棉花发展过程存在的问题  10-11
    1.2.2 转基因棉花的发展趋势  11
  1.3 转基因食品的安全性和转基因标签制度  11-14
    1.3.1 转基因食品的安全性  11-13
    1.3.2 转基因食品标签制度  13-14
  1.4 转基因作物检测技术的现状  14-17
    1.4.1 以外源核酸为基础的检测方法  14-17
    1.4.2 以外源蛋白为基础的检测方法  17
  1.5 研究内容  17-19
第2章转基因棉籽及食用油脂基因DNA的提取  19-24
  2.1 试验材料与主要设备  19-21
    2.1.1 试验材料  19
    2.1.2 主要溶液  19-20
    2.1.3 仪器与设备  20-21
    2.1.4 试剂  21
  2.2 试验方法  21-22
    2.2.1 棉籽DNA的提取方法  21
    2.2.2 食用棉籽油脂中DNA提取方法  21-22
  2.3 结果与分析  22-23
  2.4 本章小结  23-24
第3章转基因棉籽及食用油脂多重PCR检测体系的建立  24-44
  3.1 试验材料与设备  24
  3.2 试验方法  24-26
    3.2.1 多重PCR引物的设计和特异性的检测  24-25
    3.2.2 多重PCR反应体系的建立  25
    3.2.3 多重PCR反应灵敏度的检测  25
    3.2.4 多重PCR的检测  25
    3.2.5 PCR反应产物鉴定  25-26
  3.3 结果与分析  26-42
    3.3.1 PCR引物的特异性  26-31
    3.3.2 多重PCR体系的建立  31
    3.3.3 多重PCR检测转基因棉籽  31-33
    3.3.4 多重PCR检测体系实际检测市售棉籽  33
    3.3.5 多重PCR检测市售转基因棉籽的食用油脂  33-34
    3.3.6 多重PCR检出限  34-35
    3.3.7 PCR产物测序  35-42
  3.4 本章小结  42-44
第4章转基因棉籽及食用油脂多重PCR实际检测应用  44-46
  4.1 试验材料与设备  44
  4.2 试验方法  44
  4.3 结果与分析  44-45
  4.4 本章小结  45-46
结论  46-48
参考文献  48-53
致谢  53-54
作者简历  54

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