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单环刺螠硫代谢相关基因的筛选及硫醌氧化还原酶的转录调控初探

作　者: 史晓丽
导　师: 张志峰
学　校: 中国海洋大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 单环刺螠 硫醌氧化还原酶 硫代谢 转录调控
分类号: Q78
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


外源性的硫化物存在广泛，可以引起生物代谢损伤甚至死亡，富硫环境中的生物发展出了很多硫适应的机制。硫化物的氧化代谢是最重要的一种，且以线粒体氧化代谢为主。硫醌氧化还原酶是线粒体氧化代谢中的第一个关键酶。单环刺螠隶属于螠虫动物门（Echiuroidea）、螠纲（Echiurida）、无管螠目（Xenopneusta）、刺螠科（Urechidae）、刺螠属（Urechis），是一种主要栖息于近海岸潮间带或潮下带泥性底质中的海洋底栖生物。前期研究已经证明该物种具有硫化物耐受、代谢和解毒能力。本研究筛选了单环刺螠硫代谢相关的差异表达基因，鉴定了他们在组织中的表达；克隆了硫醌氧化还原酶基因5’上游调控区2505bp的序列，预测了其可能的转录因子结合位点，并克隆了通用转录因子Sp8，体外表达和纯化该重组蛋白，利用免疫学特性对Sp8和5’调控区的结合进行了验证，初步探讨了SQR的转录调控，为深入研究硫氧化代谢的分子机制提供依据。以单环刺螠50μM硫化物处理24h组为tester，未处理组为driver，采用抑制性消减杂交构建了单环刺螠硫化物下的正向消减文库，获得3456个含有差异表达基因的单克隆，进一步采用cDNA芯片技术，从该消减杂交文库克隆里筛选获得了104个差异表达基因，其中76个上调表达基因，28个下调表达基因。最终测序成功了82个差异表达基因；GO分析发现，这些基因除了参与代谢、细胞过程、免疫反应、生物调节和DNA修复等多种过程外，还包含大量的可能与硫代谢相关的未知序列。荧光定量PCR对筛选获得的基因进行验证，8条序列中有5条序列在芯片和荧光定量PCR中有很好的一致性。采用基因组步移方法获得硫醌氧化还原酶基因上游区调控序列，该调控序列全长2505bp，生物信息学发现其具有TATAbox，CAAT box等元件，且具有Sp，AP-1，E2F，HSF，c-Myb，NF-1等多个潜在的转录因子结合位点。采用同源克隆和RACE技术，对其中可能结合的转录因子Sp8进行了全长cDNA的同源克隆。单环刺螠Sp8基因全长cDNA序列为1913bp，开放阅读框1521bp，编码506个氨基酸，蛋白理论分子量为54.63kDa，理论等电点pI为9.03。克隆单环刺螠Sp8的ORF序列，并将其连入pET28a载体，构建原核表达载体pET28a-Sp8，转化大肠杆菌BL21（DE3），得到了以包涵体形式表达的Sp8；其中37℃，1mMIPTG诱导4h时表达量最高。进一步通过镍离子金属螯合柱纯化获得重组蛋白，免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体，采用染色质免疫沉淀技术对Sp8和sqr启动子区的结合进行验证，结果显示Sp8可以和sqr启动子区结合，为研究SQR的转录调控打下基础。利用改造后的EGFP-N1质粒载体，构建了包含不同调控区段序列的重组pSQR-EGFP质粒，并将全长序列重组质粒包装成慢病毒，感染哺乳动物细胞进行核基因组整合表达的研究。分别采用电转、质粒转染和慢病毒感染技术尝试将上述重组质粒转染到单环刺螠幼虫和哺乳动物细胞中进行表达研究，以期筛选活性强的单环刺螠SQR启动子序列，结果显示慢病毒感染可将该序列载入哺乳动物细胞中并成功表达，该结果为研究SQR转录条件提供基础数据。

全文目录


摘要  5-7
Abstract  7-13
第一章 前言  13-29
  1 硫化物的毒性  13-15
    1.1 抑制代谢酶  13-14
    1.2 线粒体去极化  14
    1.3 RNA 和 DNA 的氧化损伤  14-15
    1.4 神经毒性  15
  2 硫化物毒性的分子机制  15-18
    2.1 H2S 对离子通道的作用  16
    2.2 H2S 对转录因子的作用  16-17
    2.3 H2S 对激酶的作用  17-18
  3 硫氧化代谢研究  18-23
    3.1 原核生物中的硫氧化代谢  18-19
    3.2 真核生物中的硫氧化代谢  19-23
  4 硫醌氧化还原酶的研究  23-24
  5 转录因子 Sp 家族的研究  24-27
    5.1 转录因子 Sp 家族结构特征  24-26
    5.2 转录因子 Sp 家族功能  26-27
    5.3 转录因子 Sp8 研究  27
  6 本论文的研究意义  27-29
第二章 单环刺螠硫代谢相关基因的筛选及鉴定  29-56
  1 材料与方法  30-42
    1.1 材料  30
    1.2 方法  30-42
  2 结果  42-51
    2.1 总 RNA 提取  42-43
    2.2 mRNA 的分离纯化  43-44
    2.3 抑制性消减杂交  44-47
    2.4 基因芯片分析结果  47-48
    2.5 测序及同源性比对  48-50
    2.6 差异表达基因的荧光定量 PCR 验证  50-51
  3 讨论  51-56
    3.1 SSH 和 cDNA 芯片的结合  51-53
    3.2 差异表达基因的聚类  53-56
第三章 单环刺螠硫醌氧化还原酶基因启动子的克隆  56-83
  1 材料与方法  57-72
    1.1 材料  57
    1.2 方法  57-72
  2 结果  72-80
    2.1 单环刺螠 DNA 的提取  72-73
    2.2 步移文库的建立  73-76
    2.3 瞬时表达载体的构建  76-77
    2.4 细胞转染  77-79
    2.5 电转  79-80
    2.6 慢病毒感染 293 细胞  80
  3 讨论  80-83
第四章 单环刺螠硫醌氧化还原酶的转录调控初探  83-107
  1 材料与方法  84-95
    1.1 材料  84
    1.2 方法  84-95
  2 结果  95-103
    2.1 单环刺螠通用转录因子 Sp8 全长 cDNA 序列的获得  95-96
    2.2 单环刺螠 Sp8 cDNA 序列特征  96-98
    2.3 Sp 家族系统进化分析  98-99
    2.4 单环刺螠 Sp8 蛋白的生物信息学分析及结构预测  99-100
    2.5 原核表达载体的构建  100
    2.6 Sp8重组蛋白诱导表达  100-101
    2.7 Sp8体外表达蛋白的纯化  101-102
    2.8 染色质免疫沉淀  102-103
  3 讨论  103-107
    3.1 单环刺螠通用转录因子 Sp8 的序列特征  103-104
    3.2 蛋白体外表达条件  104-105
    3.3 蛋白纯化条件  105-106
    3.4 染色质免疫沉淀结果分析  106-107
结论  107-108
参考文献  108-118
致谢  118-119
个人简历  119-120
发表与待发表论文  120

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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