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miR-764-5p通过抑制CHIP/STUB1表达促进成骨细胞分化

作　者: 郭俊伟
导　师: 常智杰
学　校: 清华大学
专　业: 生物学
关键词: miR-764-5p miRNA CHIP 核心蛋白结合因子 成骨细胞
分类号: Q75
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


MicroRNAs（miRNAs）是一类大小约22个核苷酸的非编码单链RNA分子，通常其可以靶向一个或多个基因mRNA的3’非翻译区，并通过降解靶mRNA或抑制靶RNA的翻译来调控基因表达。本研究首先发现miR-764-5p在小鼠骨中存在表达，并随着骨的成熟表达逐步升高，随后证明miR-764-5p能够通过抑制泛素酶3CHIP(C terminus of Hsc70-interacting protein)/STUB1的表达来促进成骨细胞分化中重要转录因子Runx2的活性，进而促进成骨细胞的分化。前成骨细胞分化成成熟的成骨细胞受到诸如核心蛋白结合因子（Runx2）及BMP2等多种细胞因子的紧密调控。先前我们报道CHIP蛋白可以通过降解Runx2蛋白负向调控成骨细胞的分化，同时我们还发现在前成骨细胞向成骨细胞分化过程中CHIP mRNA和蛋白表达水平均逐步降低，但是CHIP在成骨分化过程中是怎样被调控的目前还没有报道，本研究旨在揭示CHIP在成骨细胞分化成熟过程中的调控机制。本研究发现miR-764-5p在成骨细胞分化过程中表达逐步上调，而CHIP的表达却逐步降低，二者表达在成骨细胞分化成熟过程中呈现出很好的负相关性，同时我们发现过表达miR-764-5p或抑制miR-764-5p表达都能导致CHIP蛋白表达水平发生相应的下调或上调，进一步实验结果表明miR-764-5p对于CHIP蛋白表达调控是通过结合CHIP3’-UTR来实现的，接下来通过Runx2特异性的萤光素酶报告分析发现miR-764-5p能够通过调控CHIP翻译，进而影响Runx2的转录活性。最后，利用RNAi技术将前成骨细胞中CHIP的表达沉默，发现miR-764-5p在失去靶目标后失去了对Runx2活性的影响，同时也失去了调控成骨细胞分化的能力，此实验证明miR-764-5p对于Runx2活性及成骨细胞分化的调控依赖于CHIP。以上研究结果揭示了CHIP在成骨细胞分化成熟过程中受miR-764-5p调控的机制，完善了人们对于调控成骨细胞分化成熟的信号网络的认识，为更好的了解成骨细胞分化成熟提供了新的信息。

全文目录


摘要  3-4
Abstract  4-9
第1章 引言  9-28
  1.1 MicroRNA 介绍  9-17
    1.1.1 miRNA 的发现  9
    1.1.2 miRNA 的命名  9-10
    1.1.3 miRNA 的产生及作用机理  10-11
    1.1.4 miRNA 的生物学功能  11-15
    1.1.5 miRNA 靶基因的预测  15-17
  1.2 E3 泛素连接酶 CHIP 的研究进展  17-19
    1.2.1 CHIP 的结构特点  17
    1.2.2 CHIP 的功能  17-19
  1.3 Runx2 在骨分化中的研究简介  19-21
  1.4 成骨细胞分化  21-27
    1.4.1 间充质干细胞  21-22
    1.4.2 成骨细胞的分化过程  22
    1.4.3 成骨细胞分化的调控  22-27
  1.5 本论文的研究目的及主要内容  27-28
第2章 实验材料与方法  28-37
  2.1 菌种及细胞  28
  2.2 抗体及底物  28
  2.3 质粒构建  28-29
  2.4 引物信息  29-30
  2.5 细胞转染  30
  2.6 稳定细胞系的建立  30
  2.7 小鼠颅骨细胞的分离与培养  30-31
  2.8 成骨细胞分化实验及鉴定  31-32
  2.9 Westren Blot  32
    2.9.1 材料  32
    2.9.2 实验方法  32
  2.10 总 RNA 的提取、miRNA 反转录及定量 PCR  32-33
    2.10.1 材料  32-33
    2.10.2 实验方法  33
  2.11 萤光素酶报告分析  33
    2.11.1 材料  33
    2.11.2 实验方法  33
  2.12 RNA 结合蛋白免疫共沉淀(RNP-IP)  33-35
    2.12.1 材料  33-34
    2.12.2 实验方法  34-35
  2.13 原位杂交  35-37
    2.13.1 材料  35
    2.13.2 实验方法  35-37
第3章 miR-764-5p 在成骨分化过程中的表达  37-42
  3.1 引论  37
  3.2 结果与分析  37-41
    3.2.1 前成骨细胞的诱导分化  37-38
    3.2.2 miR-764-5p 和 CHIP 在成骨细胞分化过程中的表达呈负相关  38-41
  3.3 小结  41-42
第4章 miR-764-5p 调控 CHIP 的分子机制  42-48
  4.1 引论  42
  4.2 结果与分析  42-47
    4.2.1 miR-764-5p 能够调控 CHIP 的表达  42-43
    4.2.2 miR-764-5p 通过结合 CHIP 3’-UTR 调控 CHIP 蛋白表达  43-45
    4.2.3 miR-764-5p 和 CHIP mRNA 存在于同一个 RISC  45-47
  4.3 小结  47-48
第5章 miR-764-5p 促进成骨细胞的分化  48-51
  5.1 引论  48
  5.2 结果与分析  48-50
    5.2.1 miR-764-5p 通过抑制 CHIP 的表达增强 Runx2 转录活性  48
    5.3.2 miR-764-5p 通过抑制 CHIP 的表达调控 Runx2 蛋白表达  48-50
  5.3 小结  50-51
第6章 miR-764-5p 促进成骨细胞分化  51-56
  6.1 引论  51
  6.2 结果与分析  51-55
    6.2.1 miR-764-5p 过量表达促进成骨细胞分化  51-53
    6.2.2 CHIP 能够抑制 miR-764-5p 引起的成骨细胞分化  53-55
  6.3 小结  55-56
第7章 结论  56-59
  7.1 全文讨论  56-57
  7.2 研究总结  57-58
  7.3 需进一步开展的工作  58-59
参考文献  59-71
致谢  71-73
个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果  73

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