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供体特异性体内细胞毒性试验方法的建立及其在移植排斥监测中的应用

作　者: 蒋泽生
导　师: 高毅；孙尔维
学　校: 第一军医大学
专　业: 普通外科
关键词: CFSE 流式细胞术细胞毒性试验移植排斥细胞示踪免疫监测
分类号: R617
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

研究背景器官移植后必需应用免疫抑制剂防止急性排斥反应的发生，免疫抑制剂通过抑制T细胞和B细胞等靶细胞的细胞增殖、细胞因子合成而起作用。但是目前仍然无法区分移植抗原引起的免疫排斥反应和病毒细菌感染引起的免疫反应。理想的免疫抑制治疗应该在免疫抑制和保持免疫力间取得平衡，因此对于临床医生来说移植患者管理是一件很困难的事。保存受体免疫力，尽可能减小免疫抑制剂用量或诱导免疫耐受一直是移植免疫学家的主要目标，这方面虽然也取得了一些令人兴奋的成果，但是诱导耐受仍然有大量的工作要做，研究诱导免疫耐受方法，尽可能减小免疫抑制的用量，研究检测免疫耐受及免疫力的免疫学方法将是今后几年器官移植所面临的最重要的挑战。可靠的免疫状态指标可以为免疫抑制剂的使用提供依据，使抑制剂不仅可以根据排斥反应的程度或耐受情况使用，还可以根据患者的易感性规范化用药，由于长期免疫抑制剂治疗所引起的的高发病率和高死亡率，高度期望规范化用药能够实现。但是，尽管通过血液标本或移植物病理分析检测免疫功能已经可以部分了解宿主抗移植物排斥反应，包括了解浸润细胞的表型及功能，T细胞性质的改变、细胞因子及抗体的合成情况等，但是仍然没有一种可靠的特异的排斥反应检测方法。目前临床常用受体免疫状态的监测的方式仍然是临床症状评估结合移植物活检。但是，活组织病理检查对移植物和宿主均是一种损伤性检查，有其固有的局限性。本课题设计了一种简单的方法，用CFSE标记供体脾细胞，流式细胞仪检测供体细胞在受体内遭受排斥反应过程，同时设置受体脾细胞作为内参照。标记的脾细胞悬液输注给不同的受体，输注后不同时间点采血进行流式细胞分析。我们发现标记的受体细胞能在外周血中稳定地存在6天，而不同的主要和次要组织相容性抗原的供体细胞在试验中消失与皮肤移植后排斥动力学相一致。这种方法为同种异体移植试验受体免疫状态的监测提供了一种简单有效的方法。同时我们也证实这种方法是一种特异的、敏感的、精确的可用于免疫学定量研究的方法。第一部分：供体特异性体内细胞毒性试验方法的建立目的：建立体内细胞毒性试验方法，探索细胞毒性试验检测的技术参数、CFSE荧光染色条件、输注细胞数及确定最佳测试时间点。方法：取C57及BALB／c小鼠脾脏制备脾细胞单细胞悬液，分别用不同浓度CFSE染色后制备1：1混合细胞悬液，建立C57—BALB／c皮肤移植排斥模型后，按混合细胞输注后不同时间点分为8组，分别为1h、2h、4h、10h、1d、2d、3d、6d组，另设未移植BALB／c小鼠为对照组，流式细胞仪检测小鼠外周血两种荧光细胞的比例变化，探索流式检测的技术参数、CFSE荧光染色条件、输注细胞数及确定最佳测试时间点。按公式计算供体特异性细胞杀伤率：％specificlysis=1—donor cells／recipient cells×100％结果：1．混合脾细胞悬液集中在淋巴细胞所在的小细胞区，单核细胞区虽然也有一部分阳性细胞，但是染色不均一，两群细胞不容易完全分开，所以选用小淋巴细胞区作为检测门。2．CFSE染色时需要较大浓度差才能完全把两群脾细胞完全分离开，在浓度相差20倍时流式直方图才显示为两个完全独立的峰；即CFSE低浓度用0.3μM，高浓度用6μM。3．C57—BALB／c皮肤移植排斥模型在皮肤移植后两周即可建立，混合细胞悬液输注后在模型组和对照组外周血中的比例变化不同，模型组与对照组输注混合细胞后1h，2h，4h，10h，1d，2d特异性杀伤率有显著差异(t=39.5，41.1，26.2，27.4，15.8，5.5，，所有P＜0.01)。模型组输注后一小时和两小时杀伤率分别高达87.4％±4.5％、92.2％±3.9％．。结论：体内抗原特异性细胞毒性试验流式检测设定在淋巴细胞门，两种细胞CFSE的染色浓度差控制在20倍左右，输注细胞总数在一定范围内对结果没有影响，输注细胞后2-4小时为最佳检测时间点，体内细胞毒性试验是一种简单、准确、稳定的免疫状态体内定量监测方法。可以全面反映小鼠皮肤移植后受体的免疫状态。第二部分供体特异性体内细胞毒性试验的特异性及敏感性研究目的：了解体内细胞毒性实验的抗原特异性，移植排斥模型理论上具有抗原特异性，仅对供体复合抗原有特异性排斥反应，对第三者对照由于体内无特异性杀伤T细胞及抗体，因此短期内没有特异性免疫排斥，体内细胞毒性试验是否有特异性可以用第三者对照检验；在免疫低下的裸鼠，对混合细胞理论上应该无特异性杀伤，实验结果可以进一步证实该方法的特异性方法：建立C57—BALB／c皮肤移植排斥模型，分别输注C57／BALB／c混合脾细胞悬液及第三者对照DBA／BALB／c混合脾细胞，流式细胞检测两种混合细胞悬液比例变化情况，同时设置BALB／c—BALB／c同系皮肤移植对照组，免疫低下裸鼠对照组，及抑制剂对照组，与排斥模型组进行对比研究。结果：只有模型组对供体C57脾细胞有强烈的特异性杀伤作用，抑制剂组特异性杀伤作用稍弱，而第三者对照结果显示细胞输注2-4小时内没有明显特异杀伤作用，免疫低下裸鼠始终未表现出特异性杀伤。S-N-K法分析显示2、4小时C57／BALB／c混合脾细胞组供体细胞杀伤率与其他组之间均有显著意义。结论：体内细胞毒性实验是一种供体抗原特异性免疫状态检测方法，可用于移植后受体免疫状态的监测。第三部分：供体特异性体内细胞毒试验的敏感性研究及其在移植后免疫状态监测中应用目的：1阐明体内细胞毒性试验的敏感性。研究体内细胞毒性试验能否在临床前期即能检测出受体的免疫排斥状况。2探索体内细胞毒性试验应用于大鼠的肝移植后免疫状态监测的可行性；方法：1应用体内细胞毒性试验监测皮肤移植后不同时间受体免疫状态，与皮肤排斥时间及移植物病理变化情况进行对比研究。按C57-BALB／c皮肤移植后天数分组，每天一姐，共13组(n=5)，分别应用体内细胞毒性试验监测每组小鼠机体免疫状态，与移植皮片状态及常规病理检查排斥状态进行对比研究。2对凋亡细胞诱导耐受的长期存活的肝移植模型大鼠进行体内细胞毒性试验，了解移植模型的免疫状态，扩大体内细胞毒性试验的应用范围。结果：1第9天移植皮肤开始脱落同时，体内细胞毒性试验即表现出抗原特异性杀伤作用，杀伤率在70％左右。说明体内细胞毒性实验能在排斥反应发生前亚临床期即能定量监测出宿主免疫状态，与移植物排斥反应发生时间一致。2凋亡细胞诱导长期存活的肝移植模型大鼠与皮肤移植排斥模型组对供体细胞杀伤率有显著差异(t=10.6，P＜0.001)，肝移植模型大鼠排斥反应小，两小时杀伤率仅为68％，远较皮肤移植模型低。结论：1体内细胞毒性试验是一种敏感的免疫状态监测方法，于移植皮肤脱落前即能检测免疫状态变化2体内细胞毒性试验可以用于监测大鼠肝移植后免疫状态及监测免疫耐受的程度。总结：供体特异性体内细胞毒性试验能直观地、准确地、稳定地、全面地、动态地反应移植物被攻击情况，且具有供体抗原特异性及较好的敏感性，是监测移植后受体免疫状态的理想方法，其特点有：1体内试验：不用模拟体内复杂的免疫环境，本身就是移植物所处的免疫环境。2检测方法准确简单：应用荧光标记流式细胞技术检测，可准确到单个细胞水平。3靶细胞：检测靶细胞为供体来源细胞(脾细胞、PBMC等)，抗原性与移植物相同，为复合抗原，容易获得，能准确反映移植物所受免疫攻击情况。4内参照细胞：为受体来源同基因细胞(脾细胞、PBMC等)，控制了试验偶然误差和系统误差；内参照细胞在体外处理及体内免疫反应的全过程始终与试验靶细胞处于同样的反应体系中，消除了由于操作及体内非特异性反应所致的误差。为试验设计创新点。

全文目录

摘要  3-8
ABSTRACT  8-16
前言  16-24
  一、排斥反应的免疫学监测  17-22
  二供体特异性体内细胞毒性试验  22-24
第一部分供体特异性体内细胞毒性试验方法的建立  24-66
  第一节体内细胞毒性试验流式细胞检测条件控制  24-32
    材料与方法  24-29
    结果  29-32
  第二节体内细胞毒性试验检测时间点的选择  32-45
    材料与方法  32-34
    结果  34-45
  第三节 CFSE染料浓度对体内细胞毒性实验结果的影响  45-47
    材料和方法  45-46
    结果  46-47
  第四节注射细胞数量对检测结果的影响  47-66
    材料和方法  47-48
    结果  48-50
    讨论  50-65
    小结  65-66
第二部分体内细胞毒性实验的特异性研究  66-82
  材料和方法  66-68
  结果  68-76
  讨论  76-82
第三部分体内细胞毒性试验敏感性研究及其在免疫排斥监测中的应用  82-101
  第一节小鼠皮肤移植后免疫状态监测及体内细胞毒性试验敏感性研究  82-90
    材料和方法  82-83
    结果  83-90
  第二节长期存活肝移植大鼠免疫状态的监测  90-101
    材料和方法  90-96
    结果  96-98
    讨论  98-101
参考文献  101-110
文献综述:受体免疫排斥状态监测研究进展  110-122
攻读学位期间成果  122-123
致谢  123-125
研究生毕业论文统计学审稿证明  125

供体特异性体内细胞毒性试验方法的建立及其在移植排斥监测中的应用

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