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NGX6基因在Wnt/Beta-catenin信号传导通路中的作用机制研究

作　者: 刘芬
导　师: 沈守荣
学　校: 中南大学
专　业: 内科学
关键词: NGX6 Wnt信号通路 结肠癌 beta-catenin TCF/LEF APC
分类号: R735.35
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


结肠癌是消化道最常见的恶性肿瘤之一,在西方国家结肠癌是癌相关性死亡的主要原因,我国结肠癌的发病率亦呈逐年上升趋势。从分子机制上阐明这一肿瘤的发生过程将会有助于我们更好地诊断和治疗该肿瘤,改善预后。经典的结肠癌癌变模式是由Vogelstein首先提出的,即从APC→K-ras→DCC→P53突变的线性发病模式。然而,最近的研究认为经典的结肠癌癌变模式只能代表少数结肠癌的发生形式,在结肠癌的癌变过程中尚存在多种不同的发生形式。因此寻找新的结肠癌相关的抑瘤基因或易感基因,并阐明其在结肠癌发生发展中的作用,已成为揭示结肠癌发病机制的关键。NGX6基因是中南大学肿瘤研究所分子遗传室采用定位侯选克隆策略克隆的一个侯选抑瘤基因（基因登陆号:AFl88239）,定位于染色体9P21-22区。9P21-22区域的等位基因杂合性丢失（loss ofheterozygosity,LOH）现象是人类多种肿瘤中的共同事件,提示NGX6可能为肿瘤相关基因。生物信息学分析该基因cDNA全长2.1Kb,编码一个含338个氨基酸的跨膜蛋白,具有两个跨膜结构（234-256,269-291）,胞外区含有一个EGF-like domain（185-221）,3个N-糖基化位点（92-95,100-103,172-175）。胞内区较短,含有一个酪氨酸激酶磷酸化位点（257-268）,提示NGX6基因可能为一跨膜蛋白,通过其EGF-like domain、酪氨酸激酶磷酸化位点、N-糖基化位点等功能域调控着细胞的增殖、黏附和运动等生物学过程。在我们的前期研究工作中发现:NGX6基因在结肠癌,尤其是有远处转移的结肠癌中表达明显下降甚至缺失,提示NGX6与结肠癌的发生发展密切相关。通过细胞转染、MTT、软琼脂集落形成及裸鼠成瘤等实验证实了NGX6在体内、体外均具有抑制结肠癌细胞增殖的作用。更令人兴奋的是在实验中发现了NGX6可抑制移植瘤内血管癌栓的形成,结合NGX6在结肠癌的表达规律的实验结果,强烈提示NGX6与结肠癌的转移相关。进一步的细胞侵袭、粘附实验和裸鼠移植瘤转移等实验证实了NGX6可抑制结肠癌细胞胞外基质粘附能力和侵袭能力,降低脾内原发灶的肝转移。FCM分析结果表明NGX6可能通过相关的信号传导通路下调cyclinE,cyclinD1和上调CKI家族成员P27的表达,延缓细胞周期G1→S的进程来抑制结肠癌增殖、转移的生物学功能。为明确其可能调控的基因网络,进一步利用cDNA microarray技术研究NGX6转染前后结肠癌细胞系HT-29基因表达谱的变化,发现了一些有价值的线索。NGX6可下调NDRG1、MMP1、ILK、ROCK2、COL11A1基因和上调DKK1、AKAP12、CSE1L、Geminin等基因的表达。其中Wnt/β-catenin信号通路上的相关分子DKK1表达上调,MMP1,ILK,COL11A1表达下调引起了我们的关注。这些分子的表达上/下调均能导致结肠癌中Wnt/β-catenin信号通路的抑制,并能够抑制结肠癌细胞的增殖和转移,而Wnt通路与结肠癌的关系十分密切。NGX6的重表达明显改变了上述分子的表达,这一信息给我们一个强烈提示:NGX6是否主要通过调控Wnt通路的激活和失活而发挥其抑瘤作用?为了明确NGX6与Wnt通路的关系,本论文从NGX6对Wnt通路下游靶分子的影响,结合阻断技术研究Wnt通路对NGX6的反馈调节,NGX6与β-catenin/TCF/LEF转录活化之间的关系深入探讨NGX6在Wnt通路中的可能的作用机制,得到了一些有意义的结果。下游靶基因的转录激活是Wnt通路被活化的最终效应。目前为止,已经发现的Wnt信号通路的靶基因多与细胞增殖、凋亡、转移相关。我们以与细胞增殖,凋亡,分化密切相关的分子c-myc,cyclinD1,c-Jun为研究对象,探讨NGX6对上述Wnt通路直接下游靶分子的影响。我们运用western-blot方法验证NGX6瞬时转染前后结肠癌细胞系SW620中c-myc,cyclinD1,c-Jun的表达,发现转染NGX6基因后c-myc,cyclinD1,c-Jun的表达量较转染前均有下降。该结果也初步提示NGX6对Wnt通路的下游靶基因具有抑制作用。那么NGX6对Wnt通路下游靶分子的抑制主要是通过什么途径发挥作用呢?生物信息学预测:NGX6是一个胞膜和胞浆蛋白,在胞浆中的定位可能是质膜成分和内质网。它的分布具有特征性,主要分布在细胞的膜质结构。因此,我们推测NGX6可能通过参与调节Wnt通路的中上游关键分子而发挥作用,这种作用可能是直接的蛋白交互作用,也可能通过中介分子而发生相互作用,在进一步的研究中寻找NGX6的交互作用蛋白将成为揭示其作用机制的关键。为了探讨Wnt通路与NGX6基因之间是否存在反馈调节作用,我们构建了真核表达载体pcDNA3.1-LEF1DN抑制该通路来研究NGX6的表达改变情况。LEF1是LEF/TCF转录因子家族的一个成员。为了使Wnt信号传递至核内的靶基因,具有N-末端的β-catenin binding domain的全长LEF/TCF蛋白是必需存在的。LEF1的表达在结肠癌中被异常激活,全长LEF1蛋白的表达明显增加,而截短LEF1蛋白的表达几乎沉默。在本文中,我们通过TCF-4荧光素酶报告质粒的方法检测到转染pcDNA3.1-LEF1DN后SW620细胞中TCF-4的荧光素酶活性是下降的,结合Western blot方法验证了Wnt通路下游靶分子的表达,均证实真核表达载体pcDNA3.1-LEF1DN对Wnt/β-catenin信号通路具有抑制作用。本文采用RT-PCR的方法,验证了结肠癌细胞系SW620中瞬时转染pcDNA3.1-LEF1DN前后的NGX6表达变化,发现NGX6的表达在转染后有上升的趋势,提示抑制Wnt/β-catenin信号通路可以上调抑瘤基因NGX6的表达,这说明NGX6与Wnt通路存在着相互反馈调节的可能,但其具体的反馈作用机制尚不明确。Wnt信号通路的核心分子是β-catenin。Wnt途径的活化使大量β-catenin进入细胞核内,与TCF/LEF形成β-catenin/TCF/LEF复合物,从而激活下游靶基因的转录。为了研究NGX6与β-catenin/TCF/LEF转录活化之间的关系,我们在内源性β-catenin含量相对较低的COS-7细胞中瞬时共转染NGX6和外源B-catenin（WT）来研究NGX6对TCF-4转录活性的影响,发现NGX6与外源β-catenin（WT）共转染比外源β-catenin（WT）单独转染的COS-7细胞TCF-4的荧光素酶报告质粒活性明显下降。这一结果给我们一个强烈提示:NGX6可能通过对β-catenin的负性调节作用来发挥它在Wnt通路中的抑制作用。我们对比了COS-7细胞和结肠癌SW620细胞在接受外源NGX6转染,而无外源β-catenin转染的情况下TCF-4转录活性的变化情况,结果发现转染NGX6后两种细胞系中的TCF-4转录活性均下降,同时我们还采用Western blot方法检测了瞬时转染NGX6后上述两种细胞系中核内β-catenin及TCF-4的表达,发现核内β-catenin及TCF-4的蛋白表达水平是明显下降的,SW620细胞的变化更为显著。该研究结果进一步提示我们,NGX6对于β-catenin的抑制作用是确切的,通过对β-catenin的核内聚集的抑制从而减少β-catenin与TCF-4的结合进而减少下游靶基因的转录活化。我们推测NGX6基因调节β-catenin可能的机制:1.增加胞浆内β-catenin的降解,减少其向核内转位,这一作用可能通过NGX6增强β-catenin“破坏复合物”中一个或多个成员的活性从而增加了β-catenin的降解,尤其是GSK-3β磷酸激酶的活性,以及其上游的抑制因子DVL-1;2.参与APC的核内—胞浆穿梭功能:（1）β-catenin/TCF-4复合物形成受到抑制;（2）β-catenin核输出增加;出核的β-catenin在胞浆内进一步被破坏复合物降解;（3）出核的β-catenin移至胞膜与E-cadherin结合增加,使得细胞间的黏附增强从而抑制转移。前期的细胞黏附与侵袭转移实验已经初步证实NGX6可以增强细胞间的黏附,可能参与转移的抑制,那么NGX6在参与负性调节Wnt信号通路中对β-catenin的抑制作用是否也通过促进β-catenin从核内输出至核外,导致核内β-catenin的表达降低,然后在胞浆内促进β-catenin被降解复合物降解或者促进β-catenin与胞膜上的E-cadhrin结合增加从而增加细胞间黏附而发挥作用呢?这些深入的机制探讨还有待更进一步的实验研究。为了更进一步明确NGX6在Wnt通路中的调控机制,我们将继续通过研究NGX6对GSK-3β活性及其磷酸化水平的影响,免疫共沉淀结合质谱技术寻找NGX6交互作用蛋白,通过分析这些蛋白的功能及其与NGX6作用的关键部位来探讨NGX6抑制Wnt通路的真正机制,为揭示结肠癌的发病分子机制提供更多的理论和实验依据。

全文目录


中文摘要  4-8
英文摘要  8-12
目录  12-14
缩略词简表  14-16
论文正文  16-65
  第一章 前言  16-22
  第二章 材料与方法  22-35
    1 材料  22-25
      1.1 细胞  22
      1.2 菌株和质粒载体  22-23
      1.3 试剂  23-24
      1.4 主要仪器  24-25
    2 方法  25-35
      2.1 真核表达载体构建  25-28
        2.1.1 目的片段的扩增  25-26
        2.1.2 胶回收目的片段  26
        2.1.3 亚克隆目的片段至T-A载体  26
        2.1.4 双酶切载体pcDNA3.1(+)和目的片段  26-27
        2.1.5 用T_4DNA Ligase连接目的片段及载体  27
        2.1.6 连接产物的转化  27-28
        2.1.7 挑选克隆,提取质粒  28
        2.1.8 双酶切鉴定及DNA测序  28
      2.2 培养细胞的蛋白质制备  28-30
        2.2.1 制备用于Western blot的总蛋白质  28-29
        2.2.2 培养细胞的胞浆及胞核蛋白制备  29
        2.2.3 BCA测蛋白浓度  29-30
      2.3 Western Blot检测Wnt通路下游靶分子的表达  30
      2.4 RT-PCR检测NGX6在各种细胞中的表达  30-32
        2.4.1 细胞总RNA的抽提  30-31
        2.4.2 用DNase-Ⅰ消化RNA中痕量DNA  31
        2.4.3 差异RT-PCR  31-32
      2.5 基因的瞬时转染  32-33
      2.6 TOPflash荧光素酶报告质粒测定  33-35
  第三章 结果  35-54
    第一部分 NGX6对Wnt/β-catenin信号通路的下游靶分子的影响  35-47
      1.NGX6转染对Wnt/β-catenin信号通路下游靶分子的影响  35-38
        1.1 pCMV-myc-NGX6及TCF-4荧光素酶报告质粒的酶切及测序鉴定  35-36
        1.2 NGX6转染对Wnt/β-catenin信号通路下游靶分子的影响  36-38
      2.抑制Wnt/β-catenin信号通路对NGX6表达的影响  38-47
        2.1 构建真核表达载体pcDNA3.1-LEF1~(DN)  38-42
        2.2 Topflash luciferase assay检测β-catenin/TCF/LEF转录因子的活性  42-43
        2.3 Western Blotting检测c-Jun、cyclinD1、c-myc的表达  43-46
        2.4 RT-PCR检测Wnt通路被抑制后NGX6的表达  46-47
    第二部分 NGX6与β-catenin/TCF/LEF转录活化之间的关系  47-54
      1.构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-β-catenin(WT)  47-49
      2.Topflash luciferase assay检测NGX6对β-catenin/TCF/LEF转录活化的影响  49-52
        2.1 转染NGX6和外源β-catenin  49-50
        2.2 转染NGX6,无外源β-catenin  50-52
      3.Western Blotting检测NGX6转染前后SW620细胞及COS-7核内β-catenin,TCF-4的表达  52-54
  第四章 讨论  54-65
    第一部分 NGX6对Wnt信号通路的下游靶分子的影响  55-59
    第二部 NGX6与β-catenin/TCF/LEF转录活化之间的关系  59-65
结论  65-66
参考文献  66-74
综述(一) Wnt/Beta-catenin/Tcf信号传导通路——大肠癌癌变的一条关键通路  74-92
综述(二) 大肠癌的分子遗传学研究进展  92-110
致谢  110-111
攻读学位期间主要的研究成果  111

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 肠肿瘤 > 结肠肿瘤
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