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表面等离子体激元共振及相关技术用于蛋白质相互作用和DNA检测

作　者: 张银堂
导　师: 周飞艨
学　校: 中南大学
专　业: 应用化学
关键词: 表面等离子体激元共振蛋白质生物分子相互作用 DNA杂交毛细管电泳分子表面固定
分类号: Q503
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
下　载: 430次
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内容摘要

表面等离子体激元共振（surface plasmon resonance,SPR）是一种检测金属表面超薄吸附层厚度和结构变化的光学技术,是研究生物分子与其它分子相互作用的有力工具,具有高灵敏、免标记、实时检测等优点,但是传统的SPR技术难以检测小分子或者弱亲和作用的反应体系,并且它需要将探针分子固定在SPR芯片表面,固定在金膜表面探针分子尤其是生物分子的活性和识别位点是否受到影响值得关注,本文针对这两方面的问题进行了如下研究:为了提高SPR的灵敏度以满足小分子检测的需求,首先,从提高SPR仪器本身灵敏度方面着手,自行搭建了双单元差分型高灵敏的SPR仪,检测灵敏度得到了一定的提高,理想情况下可达10^-5度。其次,从生物分子的组装方法入手,探讨提高SPR灵敏度的途径。用巯基十一酸（MUA）代替羧甲基葡聚糖（CM-Dextran）在中性条件下来固定金属金属硫蛋白（MT）,使MT芯片对金属离子的检测达到了很低的水平,Cd²⁺的检测下限为15ppb或0.1μM,与传统的离子分析技术有很好的可比性。再次,在现有仪器条件下,将酶催化沉淀放大技术用于SPR检测,通过对SPR信号的放大,大大提高了SPR的灵敏度,实现了超痕量DNA的检测,检测下限可达10 fM(1×10^-14M),比其它很多检测DNA方法的检出限都要低。为了研究生物分子的活性是否受表面固定的影响,同时将SPR（着重研究固/液界面）和亲和毛细管电泳（ACE）（溶液方法）两种独立的技术来研究药物（阿魏酸,FA）与蛋白质（牛血清白蛋白,BSA）的相互作用,提出了一个测定结合常数的新方法。SPR测定的结合常数(（5.1±0.6）×10⁴ M^-1)与ACE用迁移率比得到的结果(（5.6±0.4）×10⁴ M^-1)十分吻合,并且与其它方法有很好的可比性。二者的比较研究表明,BSA在SPR芯片表面的固定并没有影响它和药物作用的活性,因此用SPR来研究固液界面亲和作用是行之有效的。最后,本论文探讨不同的固定方法对蛋白质与药物相互活性的影响,分别采用共价偶联、金属螯合和静电吸附三种方法固定脂烯酰基酰基载体蛋白还原酶Ⅰ（FabI）,用SPR测定了FabI与抗菌剂三氯生的结合常数。研究表明,FabI的药物活性受固定方式的影响并不显著。另外,为了对结合在SPR芯片表面的药物分子进行鉴定,利用毛细管电泳（CE）对SPR回收液中的成分进行分析,得到令人满意的结果。通过SPR-CE联用技术研究蛋白质与抗菌剂的相互作用,提供了一个药物筛选的新思路,具有潜在的应用前景。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-14
第一章绪论  14-32
  1.1 SPR的发展历史  14-15
  1.2 SPR的基本原理  15-16
  1.3 SPR生物传感器的类型  16-20
    1.3.1 按检测方法分类  16-17
    1.3.2 按耦合方式分类  17-20
  1.4 SPR芯片的制备  20-25
    1.4.1 金属膜的制备  20-21
    1.4.2 生物分子的固定  21-24
    1.4.3 生物膜厚度对SPR灵敏度的影响  24-25
  1.5 动力学计算与平衡分析  25-28
    1.5.1 动力学计算  25-28
    1.5.2 平衡分析  28
  1.6 SPR的应用及发展  28-30
  1.7 本论文的研究背景与意义  30-32
第二章高灵敏的SPR仪器及相关技术  32-45
  2.1 自行搭建的双单元差分型SPR  32-36
    2.1.1 高灵敏的检测器  32-33
    2.1.2 双单元差分检测器的原理  33-34
    2.1.3 流动注射-SPR联用(FI-SPR)装置  34-35
    2.1.4 SPR仪器校正系数的测定  35-36
  2.2 BI-1000 SPR系统  36-37
  2.3 毛细管电泳  37-45
    2.3.1 CE的基本原理  37-39
    2.3.2 CE的分离模式  39-40
    2.3.3 检测器  40-41
    2.3.4 CE的进样方式与样品富集  41
    2.3.5 CE的柱技术  41-42
    2.3.6 CE研究亲和作用的方法  42-43
    2.3.7 CE的应用与发展前景  43-45
第三章利用高灵敏SPR技术研究apo-MT自组装单层与金属离子的相互作用  45-59
  3.1 引言  45-48
  3.2 试验部分  48-50
    3.2.1 试剂  48-49
    3.2.2 MT的固定  49
    3.2.3 FI-SPR装置  49-50
  3.3 结果与讨论  50-57
    3.3.1 MT的固定  50-51
    3.3.2 SPR实时检测Cd~(2+)和Hg~(2+)与apo-MT的相互作用  51-57
    3.3.3 Cd~(2+)、Hg~(2+)与MT结合的表观结合常数的测定  57
  3.4 结论  57-59
第四章酶催化沉淀用于SPR对DNA的超痕量检测及序列分析  59-68
  4.1 引言  59-60
  4.2 实验部分  60-62
    4.2.1 试剂  60
    4.2.2 仪器  60-61
    4.2.3 溶液的配制  61
    4.2.4 DNA"三明治"夹心结构的固定与检测  61-62
  4.3 结果与讨论  62-67
    4.3.1 酶催化沉淀的放大作用用于基因定量分析  62-64
    4.3.2 DNA检测的序列特异性  64
    4.3.3 校正曲线  64-66
    4.3.4 温度对DNA检测的影响  66-67
  4.4 结论  67-68
第五章 SPR和ACE用于阿魏酸与牛血清白蛋白相互作用的比较研究  68-80
  5.1 引言  68-70
  5.2 试剂与方法  70-73
    5.2.1 试剂  70
    5.2.2 样品和溶液的制备  70-71
    5.2.3 SPR  71
    5.2.4 CE  71-73
  5.3 结果和讨论  73-79
    5.3.1 SPR的亲和研究  73-74
    5.3.2 ACE实验条件的优化  74-78
    5.3.3 ACE测定FA/BSA的结合常数  78
    5.3.4 SPR与ACE及其它技术的比较  78-79
  5.4 结论  79-80
第六章 SPR与CE联用研究蛋白质与抗菌剂的相互作用  80-92
  6.1 引言  80-82
  6.2 实验部分  82-85
    6.2.1 试剂  82-83
    6.2.2 溶液的配制  83
    6.2.3 SPR  83-85
    6.2.4 CE  85
  6.3 结果与讨论  85-91
    6.3.1 FabI固定方法的选择  85-87
    6.3.2 FabI与三氯生相互作用的SPR分析  87-90
    6.3.3 洗脱方式的选择  90
    6.3.4 SPR回收液的CE分析  90-91
  6.4 结论  91-92
参考文献  92-113
致谢  113-114
攻读博士学位期间主要的研究成果  114-115

表面等离子体激元共振及相关技术用于蛋白质相互作用和DNA检测

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