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中药单体化合物中CFTR激活剂的筛选及药理学研究

作　者: 徐丽娜
导　师: 麻彤辉
学　校: 东北师范大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 囊性纤维化囊性纤维化跨膜转导调节因子药物筛选中药单体化合物香豆素类化合物蒽醌类化合物蛋白质质膜运送障碍纠正剂激活剂导泻机理
分类号: R285
类　型: 博士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

CFTR(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator)即囊性纤维化跨膜电导调节因子,是一种受cAMP调节的氯离子通道,在呼吸道、胃肠道、胰腺、睾丸及汗腺等处的上皮细胞广泛表达,主要参与电解质及液体的转运。该通道活动的异常与多种疾病的病理发生相关,CFTR氯离子通道功能丧失或活性降低可导致囊性纤维化、慢性胰腺炎、男性不孕、便秘和干眼病等,而功能的过度激活则与分泌性腹泻、多囊肾病等疾病的发生关系密切,因此CFTR氯离子通道高效、特异性调节剂的发现对于研究这些疾病的病理机制和治疗有重要价值。本文的目的之一是从中药单体化合物库中筛选wt-CFTR氯离子通道的激活剂并对其分子药理学特征进行系统研究。利用碘离子高度敏感的wt-CFTR氯离子通道荧光测定细胞模型,对386种中药单体化合物进行了筛选,得到了14种能够明显促进碘离子转运的单体化合物,它们在结构上分别属于香豆素类、蒽醌类、生物碱类、黄酮类及萜类等5个天然化合物家族。活性最高的是香豆素类化合物,其中的蛇床子素对wt-CFTR的EC50约为100nM/L,是迄今为止发现的对wt-hCFTR亲和力最高的天然激活剂。动物体外研究表明蛇床子素能够刺激小鼠咽喉部粘膜下腺液体的分泌以及大鼠肠粘膜上皮的氯离子短路电流,这些结果揭示了香豆素类化合物的新药理作用,并且为将它们开发为与CFTR氯离子通道功能障碍相关疾病治疗的药物提供了理论依据。另外,蒽醌类化合物也是wt-CFTR氯离子通道的有效激活剂,该类化合物是大黄类导泻药的活性成份,被广泛用于便秘的治疗,但其发挥导泻作用的确切靶点尚不清楚。本研究通过大鼠结肠短路电流分析及小鼠结肠液体分泌研究,推测大黄等中草药发挥泻下作用的主要机制之一可能是大黄酸等蒽醌类化合物对CFTR氯离子通道的直接激活。本文的另一目的是筛选?F508-CFTR氯离子通道的天然激活剂(Potentiator)及蛋白质质膜转运障碍纠正剂(Corrector)并对其分子药理学特征进行系统研究。CFTR基因突变致使其离子通道功能丧失或活性降低,从而导致囊性纤维化,该疾病影响多种器官的生理功能。其中最常见的是?F508-CFTR这种缺失突变,至少存在于90%的囊性纤维化患者的一个等位基因上,第508位苯丙氨酸的缺失在两个方面对CFTR的功能产生影响并最终造成CFTR的Cl-转运功能丧失,一方面蛋白质无法正常到达质膜,另一方面即使是能够到达质膜,通道的氯离子转运活性也明显降低。尽管目前国际上已经发现了一些能够纠正?F508-CFTR功能缺陷的小分子化合物,但在天然产物的研究方面进展甚微。本研究利用碘离子高度敏感的?F508-CFTR氯离子通道荧光测定细胞模型,从386种中药单体化合物中筛选获得了14种能够显著促进?F508-CFTR通道离子转运活性的化合物,分别属于香豆素类、蒽醌类、生物碱类、黄酮类及萜类等5个天然化合物家族。其中活性最强的是欧前胡素,EC50约为15μM/L,它们对?F508-CFTR的激活作用依赖于cAMP,且具有快速和可逆的特点,对细胞内cAMP的浓度没有影响,且与IBXM及forskolin的混合激活剂有相加作用,表明它们可能是通过与?F508-CFTR直接结合而起到激活作用的。通过构-效关系分析,推测该类化合物母核结构的第六、七、八位取代基性质共同决定了其激活作用的强弱,疏水性越强活性越高。通过扩大筛选规模或以欧前胡素为先导化合物进行结构优化,应该能够得到亲和力更高的激活剂。同时,我们也对386种中药单体化合物的?F508-CFTR质膜运送障碍纠正剂的活性进行了筛选,发现仅有白杨素能够在一定程度上促进?F508-CFTR向质膜的运送,但是与以往发现的组合小分子纠正剂相比活性较弱。通过结构修饰增强白杨素的活性可能使其在囊性纤维化及相关疾病的机理研究和药物治疗方面发挥作用。本研究通过对天然中药单体化合物进行筛选,得到了多种野生型和突变CFTR氯离子通道激活剂并对它们的激活作用进行了系统的药理学研究,这些天然化合物对于囊性纤维化及其它CFTR相关疾病的机理研究和治疗具有重要价值,同时也为将天然产物资源用于现代药物发现提供了依据。

全文目录

中文摘要  4-6
英文摘要  6-11
引言  11-13
  一、研究背景和立题依据  11-12
  二、本文的研究内容和意义  12-13
第一章文献综述  13-42
  一、CFTR 简介  13-21
    （一） CFTR 氯离子通道的结构、功能与组织表达  13-15
    （二） CFTR 突变分类及相应的药理学纠正方法  15-17
    （三） F508-CFTR 突变的细胞生物学特征  17-19
    （四） F508-CFTR 突变缺陷的纠正策略  19-21
  二、CFTR 与疾病的关系  21-29
    （一） CFTR 与囊性纤维化  21-26
    （二） CFTR 与特发性胰腺炎  26-27
    （三） CFTR 与男性不孕  27
    （四） CFTR 与分泌型腹泻  27-28
    （五） CFTR 与多囊肾病  28-29
  三、CFTR 的分子药理学研究  29-37
    （一） CFTR 抑制剂  29-33
    （二） CFTR 激活剂  33-37
  四、番泻类导泻药的作用机理研究  37-39
  五、香豆素类化合物的生物活性  39-42
第二章实验材料与方法  42-46
  一、实验材料  42-43
    （一）细胞  42
    （二）动物  42
    （三）主要试剂  42
    （四）主要设备  42-43
  二、实验方法  43-46
    （一） CFTR 氯离子通道激活剂的荧光测定方法  43-44
    （二）纠正ΔF508-CFTR 蛋白质膜运送障碍的荧光测定方法  44
    （三） CFTR 氯离子通道功能的短路电流测定方法  44
    （四） FRT 细胞及大鼠结肠粘膜cAMP 含量测定方法  44
    （五）大鼠结肠粘膜短路电流的测定方法  44-45
    （六）小鼠咽喉部粘膜下腺液体分泌的光学测定方法  45
    （七）小鼠结肠液体分泌的体内测定方法  45
    （八）统计分析  45-46
第三章结果与分析  46-56
  第一部分中药单体化合物中wt-CFTR 氯离子通道激活剂的筛选及活性研究  46-56
    一、香豆素类wt-CFTR 氯离子通道激活作用的分子药理学研究  47-51
      （一）荧光检测的剂量-效应分析  47
      （二） FRT 上皮细胞短路电流检测结果与分析  47-48
      （三）激活作用的forskolin 依赖性及动力学结果与分析  48-49
      （四） CFTR-172 对激活作用的抑制结果与分析  49
      （五）蛇床子素的动物体外活性结果与分析  49-51
    二、蒽醌类wt-CFTR 激活剂导泻作用机理研究  51-55
      （一）蒽醌类化合物对FRT 单层上皮细胞短路电流的影响  52
      （二）大黄酸对大鼠结肠粘膜上皮短路电流的影响  52-53
      （三）蒽醌类化合物对FRT 细胞及大鼠结肠粘膜上皮细胞cAMP 浓度的影响  53
      （四）大黄酸对野生型及?F508-CFTR 小鼠结肠液体分泌的影响  53-55
    三、其它天然化合物对wt-CFTR 氯离子通道的激活情况  55-56
第二部分中药单体化合物中ΔF508-CFTR通道激活剂及蛋白质质膜运送障碍纠正剂的筛选及分子药理学研究  56-66
  一、香豆素类ΔF508-CFTR 激活剂的分子药理学研究  57-63
    （一）荧光检测的剂量-效应分析  57
    （二） FRT 上皮细胞短路电流检测结果与分析  57-58
    （三） forskolin 依赖性及激活作用动力学结果与分析  58-59
    （四） CFTR_(inh)-172 对激活作用的抑制结果与分析  59
    （五）对FRT 细胞内cAMP 水平的影响  59-60
    （六）与forskolin 和IBMX 的加和效应分析  60-61
    （七）香豆素类化合物对?F508-CFTR 蛋白上膜障碍纠正作用的分析  61
    （八）香豆素类激活剂对ΔF508-CFTR 氯离子通道活性的结构-效应关系分析  61-63
  二、其它天然化合物对ΔF508-CFTR 氯离子通道的激活情况  63-64
  三、中药单体化合物中ΔF508-CFTR 质膜运送障碍纠正剂的筛选及活性分析  64-66
第四章讨论  66-69
  一、香豆素类化合物生物活性的新发现  66
  二、蒽醌类化合物对 CFTR 氯离子通道的激活作用可能是其发挥导泻作用的分子药理学基础之一  66-67
  三、F508-CFTR 天然激活剂在囊性纤维化治疗中的应用前景  67-69
本论文的结论  69-70
本论文的创新点  70-71
参考文献  71-91
英文缩写词  91-92
致谢  92-93
在学期间公开发表论文及著作情况  93

中药单体化合物中CFTR激活剂的筛选及药理学研究

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