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F蛋白裂解位点修饰与外源基因重组病毒表达对重组LaSota病毒组织亲嗜性和致病性的研究

作　者: 董俊斌
导　师: 马学恩；步志高
学　校: 内蒙古农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 新城疫病毒 LaSota疫苗株 重组病毒 电镜 免疫组化技术 气管黏膜损伤 组织嗜性
分类号: S852.5
类　型: 博士论文
年　份: 2008年
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内容摘要


重组新城疫病毒(NDV)作为活病毒载体疫苗具有很多的优点,NDV弱毒疫苗安全、有效、遗传稳定、使用方便、生产成本低廉。重组NDV应用广泛,但是重组NDV存在着免疫机理不清楚,免疫效果不理想,使用方法不明确等问题。为了优化重组NDV,本实验就重组NDV的免疫机制、应用等方面做了进一步探索和研究。1、反向遗传操作重组新城疫病毒(rLaSota)对SPF鸡气管黏膜损伤研究及病毒组织嗜性研究本研究用课题组通过反向基因操作系统获得的感染性拯救病毒rLaSota按常规剂量106EID50(100μL/羽),一次免疫2日龄、10日龄和20日龄SPF雏鸡,分别在接种后的第1、3、5、10、15、18d剖检取气管,利用组织病理学和超微病理学检测气管黏膜的损伤程度,另外对免疫的2日龄雏鸡取肝脏、肺脏、肾脏、大脑、脾脏,腺胃和十二指肠;利用免疫组化方法检测重组疫苗株在雏鸡体内的组织嗜性。结果表明,用rLaSota接种的2日龄、10日龄和20日龄SPF雏鸡,均没有表现明显临床症状,组织病理学观察发现气管黏膜巨噬细胞、浆细胞、淋巴细胞浸润,黏膜固有层水肿,黏膜上皮细胞空泡化。扫描电镜观察气管发现,杯状细胞在接种后超常增生,纤毛细胞脱纤毛,黏液成分增多,在气管黏膜表面有球形粒子,这也可能是机体免疫机制的表现。免疫组化结果表明rLaSota只在肝脏中的肝细胞中复制。2、不同外源基因插入构建的表达vvIBDV株VP2抗原和表达H5亚型重组重组NDV活载体疫苗对气管黏膜的损伤及病毒组织嗜性的研究本研究用课题组通过反向基因操作系统获得的感染性拯救病毒重组疫苗株rLasota-HAmut(GD)和rLaSota-VP2分别按常规剂量106EID50(100μL/羽)一次免疫2日龄、10日龄和20日龄SPF雏鸡,分别在接种后的第1、3、5、10、15、18d剖检取气管,利用组织病理学和超微病理学检测气管黏膜的损伤程度。另外对2日龄雏鸡取肝脏、肺脏、肾脏、大脑、脾脏,腺胃、十二指肠利用免疫组化方法检测重组病毒在雏鸡体内组织嗜性。结果表明,在免疫rLaSota-VP2、rLaSota-HAmut(GD)时,不同日龄接种,雏鸡均未表现出明显临床症状;组织病理学观察发现气管黏膜损伤程度与rLasota相似;扫描电镜观察发现,外源基因的插入的重组疫苗株对气管黏膜的损伤因外源基因的不同,损伤程度不同,HAmut(GD)对rLaSota疫苗株有较强的致弱型,rLaSota-HAmut(GD)对气管黏膜的损伤程度减弱,电镜观察在气管黏膜有大量的球形粒子。VP2基因对rLaSota疫苗株的致弱性不强,用rLaSota-VP2接种的雏鸡气管黏膜损伤程度与rLaSota相似,电镜观察在气管黏膜有球形粒子。免疫组化结果表明外源基因HAmut(GD)、VP2的插入对rLaSota病毒组织嗜性影响不大。rLaSota-HAmut(GD)接种后能在肝脏、肺脏检测到病毒,rLaSota-VP2与rLaSota相同,接种后能在肝脏检测到病毒。这说明rLaSota-VP2、rLaSota-HAmut(GD)毒力不强,而且不同日龄接种SPF鸡后,对雏鸡造成的气管黏膜损伤程度没有太明显的区别,因此rLaSota-VP2、rLaSota-HAmut(GD)可用在较小日龄的初次免疫。3、表达vvIBDV株VP2抗原重组NDV活载体疫苗、表达H5亚型重组活载体疫苗F蛋白裂解位点突变后构建的重组病毒对SPF鸡气管粘膜损伤及组织嗜性的研究在前期实验中,将rLasota-HAmut(GD)和rLaSota-VP2 F蛋白裂解位点的氨基酸由分别设计突变引物将F蛋白裂解位点的氨基酸112G-R-Q-G-R↓L117突变为112R-R-Q-R-R↓F117, 112R-R-Q-R-R↓L117命名为rl-F(M)-F, rl-F(M)-L,并拯救重组病毒。命名为rl-F(M)-F-HA,rl-F(M)-L-HA,rl-F(M)-F-VP2。分别按每只鸡常规剂量106EID50(100μL/羽)免疫2日龄SPF雏鸡,分别在接种后的第1、3、5、10、15、18d取气管、肝脏、肺脏、肾脏、大脑、脾脏、腺胃、十二指肠,利用组织病理学检测气管黏膜的损伤程度,利用免疫组化方法检测重组病毒在雏鸡体内组织嗜性,研究F蛋白裂解位点突变对病毒组织嗜性的影响。结果表明,重组毒株接种后,雏鸡均未表现任何明显临床症状;组织病理学检查发现气管黏膜损伤程度加大,几乎无完整的结构;免疫组化结果表明rLaSota-VP2、rLaSota-HAmut ( GD )疫苗株F蛋白裂解位点突变后rl-F(M)-F-HA ,rl-F(M)-L-HA,rl-F(M)-F-VP2对病毒的组织嗜性的影响比较大,均能在肝脏、肺脏、肾脏、大脑、脾脏、腺胃、十二指肠检测到病毒。这说明F蛋白裂解位点突变后气管黏膜损伤严重,组织嗜性较广,F蛋白裂解位点突变大大加大了rLaSota-VP2、rLaSota-HAmu(GD)的毒力和组织嗜性;rl-F(M)-F-HA,rl-F(M)-L-HA,rl-F(M)-F-VP2,适合较大日龄的雏鸡接种,他们均可用于雏鸡的加强免疫。本研究是国内、外首次用rLaSota为载体的重组病毒接种后研究气管黏膜损伤变化来评估病毒毒力和探索免疫机制的实验。并且在研究rLasota、rLasota-HAmut(GD)、rLaSota-VP2接种后气管黏膜损伤过程中首次发现了长有伪足样突起的3-4μm的球形粒子。也是首次提出了通过加大病毒组织嗜性来改进疫苗的临床作用的新思路,为改进rLasota-HAmut(GD)、rLaSota-VP2两种疫苗的免疫效应提供了理论依据。

全文目录


摘要  3-5
Abstract  5-15
第一篇 文献综述  15-33
  1. 新城疫概述  15-24
    1.1 NDV 的形态学  15-16
    1.2 NDV 的复制  16
    1.3 NDV 的生物学活性  16-17
    1.4 NDV 的传播  17-18
    1.5 目前影响NDV 组织嗜性的病理因素的研究  18-21
    1.6 NDV 的免疫  21-22
    1.7 NDV 的诊断技术  22-24
  2 鸡传染性法氏囊病毒VP2 基因简介  24
  3 高致病性禽流感HA 基因简介  24-25
  4 负链RNA 病毒反向遗传操作系统及其应用研究  25-26
  5 本文研究的意义  26-27
  参考文献  27-33
第二篇 实验研究  33-115
  实验一 反向遗传操作重组新城疫病毒（RLASOTA）气管黏膜损伤研究及病毒组织嗜性研究  33-51
    1 材料与方法  33-37
      1.1 抗体和病毒  33
      1.2 主要试剂和仪器  33-34
      1.3 主要溶液的配制  34-35
      1.4 实验动物  35
      1.5 动物免疫与取材  35
      1.6 利用ELISA 实验检测血清中抗体  35-36
      1.7 常规制片(H.E)染色过程  36
      1.8 扫描电镜观察  36
      1.9 免疫组化检测  36-37
      1.10 病毒含量测定  37
    2. 结果  37-47
      2.1 血清中IgG 含量测定  37-38
      2.2 剖检病变  38
      2.3 病理切片观察  38-41
      2.4 电镜观察结果  41-46
      2.5 免疫组化检测  46-47
      2.6 病毒在鸡体内不同组织中的含量  47
    3. 讨论  47-49
    参考文献  49-51
  实验二 传染性法氏囊病毒超强毒株VP2基因重组新城疫病毒活载体疫苗(RLASOTA-VP2）气管黏膜损伤及病毒组织嗜性研究  51-67
    1 材料与方法  51-53
      1.1 抗体和病毒  51-52
      1.2 主要试剂和仪器  52
      1.3 主要溶液  52
      1.4 实验动物  52
      1.5 动物免疫与取材  52
      1.6 利用ELISA 测定血清中IgG 含量  52-53
      1.7 常规病理切片（HE）观察  53
      1.8 电镜观察  53
      1.9 免疫组化检测  53
      1.10 病毒含量测定  53
    2. 结果  53-63
      2.1 血清中IgG 含量测定  53-54
      2.2 剖检病变  54
      2.3 病理切片观察  54-57
      2.4 电镜观察  57-62
      2.5 免疫组化检测  62-63
      2.6 病毒在鸡体内不同组织中的含量  63
    3. 讨论  63-66
    参考文献  66-67
  实验三 H5N1 亚型禽流感病毒HA 基因重组新城疫病毒活载体疫苗株（RLASOTA－HAMUT（GD））气管黏膜损伤及组织嗜性研究  67-80
    1 材料与方法  67-69
      1.1 抗体和病毒  67-68
      1.2 主要试剂和仪器  68
      1.3 主要溶液  68
      1.4 实验动物  68
      1.5 动物免疫与取材  68-69
      1.6 利用ELISA 测定血清中IgG 抗体  69
      1.7 常规切片（HE）观察  69
      1.8 电镜观察  69
      1.9 免疫组化检测  69
      1.10 病毒含量测定  69
    2. 结果  69-77
      2.1 血清中IgG 含量测定  69-70
      2.2 剖检病变  70
      2.3 病理切片观察  70-73
      2.4 电镜结果  73-75
      2.5 免疫组化检测  75-76
      2.6 病毒在鸡体内不同组织中的含量  76-77
    3. 讨论  77-79
    参考文献  79-80
  实验四 表达H5 亚型重组新城疫病毒活载体疫苗F 蛋白裂解位点突变后构建的重组毒株的病毒RL-F(M)-F-HA 组织嗜性的研究  80-93
    1 材料与方法  81-83
      1.1 抗体和病毒  81-82
      1.2 主要试剂和仪器  82
      1.3 主要溶液  82
      1.4 实验动物  82
      1.5 动物免疫与取材  82
      1.6 利用ELISA 测定血清中IgG 含量  82-83
      1.7 病理切片（HE）观察  83
      1.8 免疫组化检测  83
      1.9 病毒含量测定  83
    2. 结果  83-90
      2.1 血清中IgG 含量的测定  83-84
      2.2 剖检病变  84
      2.3 气管病理切片观察  84-85
      2.4 免疫组化结果  85-89
      2.5 病毒在鸡体内不同组织中的含量  89-90
    3 讨论  90-92
    参考文献  92-93
  实验五 表达H5 亚型重组新城疫病毒活载体疫苗F 蛋白裂解位点突变后构建的重组毒株的病毒RL-F(M)-L-HA 组织嗜性的研究  93-104
    1 材料与方法  93-95
      1.1 抗体和病毒  93-94
      1.2 主要试剂和仪器  94
      1.3 主要溶液  94
      1.4 实验动物  94-95
      1.5 动物免疫与取材  95
      1.6 利用ELISA 测定血清中IgG 含量  95
      1.7 病理切片观察  95
      1.8 免疫组化检测  95
      1.9 病毒含量测定  95
    2. 结果  95-101
      2.1 血清中IgG 含量检测  95-96
      2.2 剖检病变  96
      2.3 病理切片观察  96-97
      2.4 免疫组化结果  97-100
      2.5 病毒在鸡体内不同组织中的含量测定结果  100-101
    3 讨论  101-103
    参考文献  103-104
  实验六 表达VVIBDV 株VP2 抗原重组NDV 活载体疫苗F 蛋白裂解位点突变后构建的重组毒株的病毒RL-F(M)-F-VP2 组织嗜性的研究  104-115
    1 材料与方法  104-106
      1.1 抗体和病毒  104-105
      1.2 主要试剂和仪器  105
      1.3 主要溶液  105
      1.4 实验动物  105
      1.5 动物免疫与取材  105-106
      1.6 利用ELISA 测定血清中IgG 含量  106
      1.7 病理切片观察  106
      1.8 免疫组化检测  106
      1.9 病毒含量测定  106
    2. 结果  106-112
      2.1 血清中IgG 含量检测结果  106-107
      2.2 剖检病变  107
      2.3 病理切片观察结果  107-108
      2.4 免疫组化结果  108-112
      2.5 病毒在鸡体内不同组织中的含量测定结果  112
    3 讨论  112-114
    参考文献  114-115
全文总结  115-116
致谢  116-117
附图  117-118
作者简介  118

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 血清学
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