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槌果藤乙醇提取物对进行性系统性硬化症患者成纤维细胞I型胶原产生的影响及其作用机理研究

作　者: 曹越兰
导　师: 郑敏
学　校: 浙江大学
专　业: 皮肤性病学
关键词: 进行性系统性硬化症结缔组织生长因子，转化生长因子基质金属蛋白酶氧化应激槌果藤
分类号: R593.2
类　型: 博士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

[研究背景]进行性系统性硬化症（PSS）是以局限性或弥漫性皮肤和内脏器官结缔组织的纤维化或硬化,最后导致功能障碍为特点的疾病,PSS患者的成纤维细胞胞外基质（ECM）合成增加是皮肤、内脏纤维硬化的主要原因之一,其中尤以Ⅰ型胶原增多显著。TGF-β、CTGF是主要的促纤维化细胞因子,在PSS中表达增高,通过促进胶原等基质基因的转录及合成参与PSS的发病。分解减少是PSS患者ECM堆积的另一重要原因,基质金属蛋白酶（MMPs）及其抑制剂金属蛋白酶组织抑制物（TIMPs）是关键的ECM降解酶体系,TIMPs与活化状态的MMPs以1:1克分子比例非共价结合,抑制MMPs的活性。其中MMP-1、MMP-3及TIMP-1、TIMP-3与PSS患者发病关系密切,PSS患者TIMP-1,3产生增加,MMP-1,3合成减少、活性降低导致ECM降解减少。近年来研究表明氧化应激参与硬皮病的发病,PSS患者的单核细胞、成纤维细胞产生O_2^-、H₂O₂水平显著高于正常人,细胞内活性氧（ROS）水平明显增加,增高的ROS不仅可通过ROS-ERK1/2-Ha-Ras信号链,而且可通过诱导TGF-β1、CTGFmRNA表达和活化促进胶原等基质基因表达,并且可诱导PAI、TIMP-3合成,减少基质降解。槌果藤在新疆作为一种民族药而被广泛应用,化学研究表明:槌果藤中含有挥发油（异硫氰酸酯、麝香草酚、棕榈酸等）、吲哚类、类黄酮类、谷甾醇类、葡萄糖异硫氰酸盐及一些结构新颖的化合物,药理学研究表明,槌果藤具有抗菌、抗炎、抗氧化、保肝、降血脂血糖等作用,其中抗氧化作用尤其引人瞩目。曾有报道用槌果藤鲜果泥膏外敷治疗局限性硬皮病,疗效显著,但局部刺激反应明显,并缺乏药理、作用机理方面的研究报道。研究槌果藤乙醇提取物对PSS患者成纤维细胞胶原产生的影响及作用机理探讨有助于该药的进一步开发应用。[目的]明确槌果藤乙醇提取物对PSS患者成纤维细胞增殖、Ⅰ型胶原mRNA表达、蛋白合成的影响,通过研究槌果藤乙醇提取物对PSS患者成纤维细胞TGF-β1、CTGF,ECM降解酶体系（MMP-1,3、TIMP-1,3）及活性氧水平的影响探讨该提取物是否通过抑制促纤维化细胞因子表达、促进降解或抗氧化应激而发挥其抗纤维化作用。并排除该提取物的细胞毒性。[方法]第一部分:正常人、PSS患者成纤维细胞的分离、原代培养,提取总RNA和蛋白质。以MTT法检测槌果藤乙醇提取物对PSS患者成纤维细胞增殖的影响;以AnnexinV-FITC/PI染色用流式细胞仪检测该提取物对PSS患者成纤维细胞凋亡的影响;以逆转录-聚合酶链反应（Reverse transcript polymerasechain reaction,RT-PCR）检测该提取物对PSS患者成纤维细胞Ⅰ型胶原mRNA表达的影响;以Western-blot法检测该提取物对PSS患者成纤维细胞Ⅰ型胶原蛋白合成的影响。第二部分:以逆转录-聚合酶链反应（Reverse transcript polymerase chainreaction,RT-PCR）检测该提取物对PSS患者成纤维细胞TGF-β1、CTGF、ECM降解酶体系（MMP-1,3、TIMP-1,3）mRNA表达的影响;以免疫荧光法、Western-blot法检测该提取物对PSS患者成纤维细胞TGF-β1、CTGF蛋白表达的影响。第三部分:用细胞色素C还原法检测该提取物对PSS患者成纤维细胞超氧阴离子产生的影响;用高香草酸-辣根过氧化酶法检测该提取物对PSS患者成纤维细胞过氧化氢产生的影响;用DCFH-DA荧光探针经荧光纤维镜观察、流式细胞仪检测该提取物对PSS患者成纤维细胞内ROS水平的影响;以AnnexinV-FITC/PI染色用流式细胞仪检测该提取物对H₂O₂诱导PSS患者成纤维细胞凋亡的保护作用。[结果]一、槌果藤乙醇提取物剂量依赖性地抑制PSS患者成纤维细胞的增殖,对正常人成纤维细胞的增殖无影响,加药后与未加药的成纤维细胞形态无明显差异,凋亡、死亡细胞无明显增多。二、槌果藤提取物可显著抑制PSS患者成纤维细胞Ⅰ型胶原mRNA表达,并呈时间和剂量依赖性;可剂量依赖性地抑制PSS患者成纤维细胞Ⅰ型胶原蛋白的合成。三、槌果藤提取物可显著抑制PSS患者成纤维细胞CTGFmRNA表达,并呈时间和剂量依赖性;可剂量依赖性地抑制PSS患者成纤维细胞CTGF蛋白的表达。对TGF-βmRNA表达、蛋白合成无影响。四、槌果藤提取物可上调PSS患者成纤维细胞MMP-1、抑制TIMP-3 mRNA表达,并呈时间和剂量依赖性。五、槌果藤提取物可剂量依赖性地抑制PSS患者成纤维细胞O_2^-、H₂O₂的产生,剂量依赖性地降低PSS患者成纤维细胞内ROS的水平。六、槌果藤提取物可显著降低H₂O₂诱导的成纤维细胞凋亡。[结论]一、槌果藤乙醇提取物通过抑制PSS患者成纤维细胞增殖、Ⅰ型胶原基因转录和蛋白合成而发挥抗皮肤纤维化作用。该提取物在100μg ml^-1无明显细胞毒性。二、槌果藤提取物通过抑制PSS患者成纤维细胞CTGFmRNA表达、蛋白合成,抑制I型胶原的合成。通过上调MMP-1、抑制TIMP-3mRNA表达促进ECM降解。三、槌果藤乙醇提取物可抑制PSS患者成纤维细胞O_2^-、H₂O₂的产生,降低PSS患者成纤维细胞内ROS的水平,对H₂O₂诱导的成纤维细胞凋亡有明显的保护作用。即槌果藤乙醇提取物可显著降低PSS患者氧化应激状态。

全文目录

中文摘要  5-8
英文摘要  8-12
研究背景  12-28
第一部分槌果藤乙醇提取物对进行性系统性硬化症患者成纤维细胞增殖和Ⅰ型胶原产生的影响  28-44
  前言  28
  实验材料  28-29
  实验方法  29-35
  实验结果  35-40
  讨论  40-43
  结论  43-44
第二部分槌果藤乙醇提取物对进行性系统性硬化症患者成纤维细胞促纤维化细胞因子、基质金属蛋白酶及其抑制因子的作用研究  44-61
  前言  44-45
  实验材料  45
  实验方法  45-48
  实验结果  48-57
  讨论  57-60
  结论  60-61
第三部分槌果藤对进行性系统性硬化症患者成纤维细胞氧化应激的影响研究  61-77
  前言  61-62
  实验材料  62
  实验方法  62-65
  实验结果  65-72
  讨论  72-76
  结论  76-77
参考文献  77-89
综述  89-102
致谢  102

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