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急性白血病MLL基因重排的检测及临床特点研究以及基因断裂融合检测新方法初探

作　者: 葛晓燕
导　师: 王宏伟
学　校: 山西医科大学
专　业: 血液内科学
关键词: 急性白血病融合基因 MLL RARα AML1
分类号: R733.7
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

目的1研究急性白血病(acute leukemia,AL)中混合谱系白血病(mixed lineage leukemia,MLL)基因重排的多重巢式(multiplex nested)RT-PCR方法检测,并探讨其生物学和临床特点。2研究AL中MLL基因重排在监测微小残留病(minimal residual disease,MRD)中的作用和意义。3建立一种检测RARfα、AML1及MLL等基因断裂融合的新的筛选方法。方法1 MLL基因重排的检测1.1对171例AML和76例ALL患者用Multiplex Nested RT-PCR方法进行MLL基因重排的检测,选取转录因子E2A作为内对照同步进行转录和扩增。检测的MLL基因重排包括MLL/AF4、MLL/AF6、MLL/AF9、MLL/AF10、MLL/AF17、MLL/EL、LMLL/ENL、MLL/AFX1、MLL/IP、MLI/1Q和MLL-PTD等11种。1.2流式细胞技术采用活细胞三色荧光标记检测的免疫表型。1.3对部分AL患者作染色体核型分析。2 B/C比值法的建立2.1 B区和C区引物设计在正常RARα、AML1和MLL的cDNA模板上,分别针对RARα、和MLL基因的断裂点区B区(Breakpoints region)设计引物,上游引物和下游引物分别位于断裂点区两端,并在非断裂位点区C区(Control region)作为内对照,分别设计引物C1和C2。2.2最佳线性循环扩增数的确定取正常对照cDNA,分别用RARα、AML1和MLL基因的B区和C区引物,根据各自的反应条件进行扩增,循环数依次为26、28、30、32、34、36。然后取扩增产物电泳,记录条带灰度值,并做出线性扩增曲线,确定最佳线性循环数。2.3确定反应所需的骨髓原始细胞最低比例NB4细胞系(PML/RARα阳性)和K562细胞系(PML/RARα阴性)按一定比例混合(NB4细胞占细胞总数的0%,10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%)共形成11组混合细胞,提取RNA后以RARα基因的扩增条件和循环数进行RT-PCR,从细胞系水平确定反应所需的最低原始细胞比例。选取骨髓原始细胞比例为96.4%的PML/RARα融合基因阳性标本,按15%、30%、45%、60%、75%、90%原始细胞比例与正常对照混合,分别测定B/C值,从病例水平确定B/C比值法要求的入选标本最低原始细胞比例。2.4 B/C比值法准确性验证选取30例已知PML/RARα阳性标本和正常对照各30例以B/C比值法检测,计算B/C值,进行统计学分析;常规RT-PCR方法检测PML/RARα、AML1/ETO融合基因和MLL基因重排阳性者,分别作B/C比值法检测,计算B/C值,与正常对照比较。结果1 AML中MLL基因重排及特点1.1在171例AML中MLL基因重排者占7.6%(13/171),FAB分型中7例为M5,4例为M4,2例为M2。MLL基因重排者白细胞数(WBC)显著增高,髓系抗原表达均为阳性,其中3例合并CD19或CD22等淋巴系抗原表达。1.2 13例MLL基因重排阳性AML中2例MLL/AF6,4例MLL/AF9,1例MLL/AF17、1例MLI/ELL,2例MLL/AF10,3例MLL-PTD。1.3 13例MLL基因重排阳性AML中12例接受治疗,10例患者获得完全缓解(complete remission,CR)。但总生存期较短。1.4对8例AML患者定期监测相应的MLL基因重排,发现持续阴性者可长期存活,阳性者则很快复发。2 ALL中MLL基因重排及特点2.1在76例ALL中MLL基因重排者占10.56%(8/76),均为B-ALL。其中4例MLL/AF4和1例MLI/ENL为pro-B ALL,其余3例为pre-B/common B-ALL。8例MLL基因重排ALL中CD19、CD79a或CD22等淋巴系抗原表达均为阳性,其中2例合并CD13或CD33等髓系抗原表达。2.2其中MLL/AF4有4例,MLI/ENL、MLL-PTD、MLL/AF6和MLL/AF10各1例。2.3 8例MLL基因重排ALL接受治疗,获得CR。2.4对6例ALL患者CR后定期监测相应的MLL基因重排,发现持续阴性者可长期存活,阳性者则很快复发。3 B/C比值法的建立3.1 B/C比值法PCR反应条件的建立根据扩增曲线,确定RARα、AML1和MLL基因最佳线性扩增循环数分别为30、30和31。3.2骨髓原始细胞比例的B/C比值法纳入标准对11组不同比例混合的NB4细胞和K562细胞,及PML/RARα融合基因阳性标本与正常对照细胞不同比例混合的标本,检测RARα的B/C值,进行统计学分析。确定该方法适用的最低原始细胞比例为30%。3.3 B/C比值法准确性验证原始细胞30%以上的PML-RARα融合基因阳性与正常对照各30例进行PCR反应,PML-RARα融合基因阳性B/C比值为(0.5605±0.1853),与正常对照(1.1396±0.1147)比较有显著的统计学意义(p<0.05)。原始细胞30%以上的AML1-ETO融合基因阳性16例与正常对照标本20例比较,B/C比值有显著的统计学意义(p<0.05);原始细胞30%以上的MLL基因重排17例与正常对照标本20例比较,B/C比值有显著的统计学意义(p<0.05)。3.4 B/C比值异常的标本发现15例AML1-ETO融合基因阴性而AML1 B/C比值异常的标本和2例MLL基因重排阴性而MLL B/C比值异常的标本。结论1多重RT-PCR是临床检测MLL基因重排较为精确和灵敏的方法。2在AML中MLL基因重排是FAB亚型M4和M5常见的基因改变,多见于WBC增高患者;ALL中MLL基因重排以MLL/AF4为主,多见于pro-B ALL。MLL基因重排的急性白血病AL患者CR率与阴性者无明显差异,但预后较差。3 MLL基因重排可作为MRD的监测指标,在AL判断复发和治疗方案的个体化选择及预后方面有重要意义。4 B/C比值法是一种创新性的方法。实质是一种半定量PCR方法,是一种有效的判断RARα、AML1和MLL基因断裂融合的方法,可作为临床患者常规RARα、AML1和MLL融合基因检测的补充方法,对涉及RARα、AML1和MLL基因的融合断裂进行初筛。断裂位点恒定的其它基因断裂融合也可设计应用该方法进行检测。

全文目录

中文摘要  5-8
英文摘要  8-11
主要符号表  11-12
第一章应用多重巢式 RT—PCR检测急性髓性白血病 MLL基因重排及其临床特点研究  12-30
  1.1 前言  12-15
  1.2 材料与方法  15-23
  1.3 结果  23-26
  1.4 讨论  26-30
第二章应用多重巢式 RT—PCR检测急性淋巴细胞白血病 MLL基因重排及其临床特点研究  30-40
  1.1 前言  30-31
  1.2 材料与方法  31-35
  1.3 结果  35-38
  1.4 讨论  38-40
第三章检测 RARα、AML1、MLL基因断裂融合的新方法初探  40-58
  1.1 前言  40-42
  1.2 材料与方法  42-47
  1.3 结果  47-52
  1.4 讨论  52-58
结论  58-59
参考文献  59-67
综述  67-78
  正文  67-75
  参考文献  75-78
个人简介  78-79
致谢  79

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