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红系分化相关基因分析及人造血相关miRNA和miRNA基因簇的初步研究
作 者: 余佳
导 师: 张俊武
学 校: 中国协和医科大学
专 业: 生物化学与分子生物学
关键词: 红系分化 医科大学 基因簇 人造血 协和 靶基因 特异性表达 细胞系 链系 差异表达分析
分类号: Q75
类 型: 博士论文
年 份: 2007年
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内容摘要
血细胞形成是生物体发育和生命维持最重要的环节之一。机体内对血细胞形成过程的调控包含两方面:(1)造血干细胞的自我更新,即多能造血干细胞自我复制;(2)造血干/祖细胞的分化,即造血干/祖细胞向至少8个血细胞链系的分化决定并继续发育分化为成熟的细胞。造血干细胞向红系的分化决定和继续分化发育成熟是多个基因有序地开启(或表达增强)和关闭(或表达降低)的结果。它们的表达异常可能导致血液病的发生。K562细胞系是一种人红白血病细胞系,基本处于多能髓样祖细胞阶段而停止继续分化。在氯高铁血红素(Hemin)诱导下可继续红系分化过程。为进一步获得分化过程中相关基因表达的信息,我们应用改良的差异显示RT-PCR技术(DDRT-PCR),分析K562细胞在Hemin诱导的红系分化前后的基因表达变化,共获得357条差异表达带。对其中差异表达明显的314条进行再扩增、克隆和测序,其中201条表达上调,85条表达下调。对这些差异表达EST的生物信息学分析发现,237个EST与GenBank中已知序列有95%以上同源性,45个为只与dbEST有高度同源的序列,4个未发现同源序列。这些已知基因多为信号转导分子、分化相关分子、细胞凋亡相关分子、肿瘤相关分子、染色质结构蛋白和氧化还原酶及其它酶类等,还有一些已知cDNA而未知功能的基因和几个可能的新基因。同时,我们也运用Microarray技术分析了K562细胞红系分化前后的miRNA表达,获得了21个差异表达miRNA。这些结果为确定红系分化相关基因及调控网络提供了重要线索。miRNA是一类长度约为21-23个核苷酸的重要调节分子,它可以通过mRNA剪切或翻译抑制的方式在转录后水平抑制蛋白编码基因表达。迄今为止在植物和动物中已发现编码miRNA的基因1000余个。miRNA在许多发育和生理过程中起着重要的作用,但目前已阐明部分功能和作用机制的miRNA只有少数。近来Bartel等报告mir-223在小鼠骨髓中特异性表达。为研究mir-223在人类造血中的功能作用,本论文首先用Northern杂交方法分析了其在人正常组织中的表达,发现mir-223在人淋巴结、肝和骨髓中高表达,在其他组织中低或无表达,这与Bartel在小鼠组织的杂交结果有部分区别。随后通过密度梯度离心结合抗体磁珠分选的方法从脐血单个核细胞中分离出5种链系细胞(T、B、粒、单核和红系),检测了mir-223表达,结果表明mir-223在红系和T系表达较低,在B系中等程度表达,而在单核系和粒系中高表达。之后检测了mir-223在9个白血病细胞系中的表达,发现其不但在2个髓系来源白血病细胞系HL-60和THP-1中表达,也在2个红白血病细胞系K562和HEL中表达。但在小鼠红白血病细胞系MEL585和GM979中却未检测出mir-223表达。这些情况暗示,在作为比小鼠更高级的哺乳动物—人中,miRNA可能在发育过程中调控更多的生理和病理进程。为进一步研究mir-223在人红系分化发育中的功能,我们以K562和HEL为研究模型,分析外源性抑制或过表达成熟mir-223后对两种细胞生长和分化的影响。结果表明,外源性抑制或过表达成熟mir-223对两种细胞的增殖和凋亡没有影响,而外源性抑制了成熟mir-223的两种细胞在用Hemin向红系诱导后,相比于对照Hemin诱导组,均表现出一定程度的红系分化增强。这表明mir-223可能在人红系分化中具有一定抑制作用,但尚需进一步研究。许多证据表明多个miRNA可能以协同方式在某一生物过程中发挥作用。本研究首先使用Altuvia等的方法分析了所有已注册的326个人miRNA基因的基因组定位情况,发现148个miRNA基因组织在51个miRNA基因簇里,并用启动子分析得到验证。序列相似性分析揭示在不同的miRNA基因簇之间存在许多高度同源的miRNA基因。为进一步探究这些成簇miRNA在人造血系统中的功能,我们用northern blot方法分析了它们在不同的人白血病细胞系中的表达。结果说明在39个miRNA簇中,属于同一个簇的miRNA成员在不同的人造血细胞系中具有一致性表达。不一致的表达在另12个基因簇中发现。从中鉴定了几个造血链系特异或丰富表达的miRNA簇(例如:mir-29c,mir-302,mir-98,mir-29a和let-7a-1簇等)以及几个链系特异表达的miRNA(例如:mir-181c,mir-181d,mir-191和mir-136等),提示这些miRNA可能在相应的人造血链系分化或白血病发生过程中起重要作用。这些结果为造血细胞分化机制特别是红系分化详细机制和调控网络的揭示提供了有意义的资料和重要线索,并可能对造血细胞分化相关疾病的研究和治疗提供潜在的线索。
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全文目录
中文摘要 7-9 英文摘要 9-12 前言 12-18 材料与方法 18-44 一.材料 18-24 1.细胞系与脐带血 18 2.菌株与质粒 18-20 3.工具酶及分子量标准 20 4.试剂盒 20-21 5.主要生化试剂 21 6.主要仪器 21 7.放射性标记化合物 21-22 8.引物 22-23 9.分析软件 23-24 二.实验方法 24-44 1.细胞学实验 24-27 2.RNA提取 27-28 3.RNA的质量检测 28 4.DDRT-PCR分析 28-34 5.Northern杂交 34-35 6.miRNA基因簇的鉴定与同源性分析 35 7.miRNA的PAGE/Northern杂交 35-37 8.质粒的构建 37-40 9.细胞的联苯胺染色 40 10.细胞中蛋白的提取和Western Blotting 40-43 11.K562细胞红系分化相关miRNA-Microarray 43-44 结果 44-86 第一部分 红系分化前后mRNA和miRNA差异表达分析 44-52 1.K562细胞红系分化前后mRNA差异表达分析 44-49 2.K562细胞红系分化前后miRNA差异表达microarray分析 49-52 第二部分 mir-223的表达鉴定及初步功能分析 52-64 1.mir-223的生物起源及靶基因分析 52-53 2.mir-223的表达鉴定 53-58 3.mir-223功能的初步研究 58-64 第三部分 人miRNA簇基因组组织及造血表达谱分析 64-86 1.人miRNA簇基因组组织 64 2.人miRNA基因簇启动子分析 64-70 3.人miRNA基因簇同源性分析 70-74 4.人miRNA基因簇的造血表达分析 74-86 讨论 86-93 一.使用改进的DDRT-PCR技术筛选红系分化相关EST 87-88 二.使用miRNA-Microarray和PAGE/Northern方法分析miRNA表达 88-89 三.miRNA-Microarray和PAGE/Northern表达数据分析 89-90 四.miRNA-223在人造血组织中的表达鉴定和初步功能分析 90-91 五.人miRNA基因簇的鉴定与造血表达分析 91-93 展望 93-94 参考文献 94-100 小结 100-101 英文名词及缩写 101-103 文献综述(一) 103-117 文献综述(二) 117-134 攻读博士期间发表和待发表论文 134-135 致谢 135
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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 分子遗传学
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