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还原脱氯微生物的生物固氮研究

作　者: 琚雄飞
导　师: 孙宝林
学　校: 中国科学技术大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 还原脱氯 生物固氮 nifH基因 逆转录PCR 固氮基因簇 生物修复 BAC文库
分类号: Q93
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


大量人为及自然产生的氯代有机物被源源不断地释放到坏境中，这些化合物大部分都是有毒的，并且在坏境中不断蓄积，它们的广泛分布对人类公共健康和环境产生了潜在威胁。许多有机氯代物都能对抗好氧微生物的降解代谢，主要是由于氯位取代阻止了氧化酶的攻击。幸运的是还原脱氯微生物在厌氧环境下，通过还原脱氯的方式来降解氯代污染物，厌氧的环境主要包括厌氧的土壤、地下水以及沉积的淤泥等，而由还原脱氯产生能量耦连代谢生长的过程称为“脱氯呼吸”。根据微生物富集、碳同位素分离以及分子生物学的研究，已经发现还原脱氯微生物在自然界中广泛分布，暗示它们在生物修复和全球氯循环方面起着重要的作用。在国际上，研究含氯有机物在环境中的归宿及生物降解已成为近年来微生物生态学及环境科学的重要方向。中国人口众多，自然资源有限，环境生态问题尤为突出，环境质量和人们的生存及可持续发展密切相关，因此，加强这些方面的研究已显得刻不容缓。生物固氮是在共生、联合或自生固氮微生物的作用下，将空气中的氮气直接还原成氨的过程，对生态平衡的维系、全球农业以及全局性的氮循环方面影响重大。尽管在真核生物中没有发现固氮现象，但已经发现的固氮微生物广泛存在于细菌和古细菌中，揭示了固氮微生物的生物多样性。这种重要的生理学特征在还原脱氯微生物中还尚未发现，根据三种还原脱氯细菌全基因组测序的结果，在D.hafniense strain Y51和Dehalococcoides strain 195中都发现了固氮相关的基因，而在Dehalococcoides strain CBDB1基因组中没有发现固氮相关基因，本课题的研究任务就是找到还原脱氯微生物进行生物固氮的依据。在厌氧脱氯微生物的作用下，有机氯代化合物可通过还原脱氯反应，转化成无毒或低毒产物，还原脱氯细菌生态、生理以及遗传学的重要进展揭示了它们在生物修复和全球的氯循环方面起着极其重要的坏境学意义。目前通过富集、分离以及纯化等手段已经获得了多种能进行纯培养的还原脱氯微生物，而对这些还原脱氯微生物进行生物固氮的研究不仅有助于阐明其生理、生化特性，揭示其在进化上的意义，而且有助于调节还原脱氯微生物治理污染坏境中的功能。我们首次利用已分离纯化的多种具有代表性的还原脱氯微生物为研究材料，在生理水平和分子水平来研究它们固氮活性，并通过对其在不同生长环境下固氮活性的检测以及固氮基因表达的定性定量研究，阐明还原脱氯反应与固氮是否具有相关性，进而理解还原脱氯微生物的进化原理和固氮基因的来源。在我们的研究中，首次从生理学和分子生物学水平揭示了还原脱氯微生物进行固氮功能的依据，并发现3-氯苯甲酸还原脱氯细菌（Desulfomonile tiedjei DCB-1）和2-氯苯酚还原脱氯细菌（Desulfovibrio dechloracetivorans SF3）在特定电子供体存在的情况下，固氮与还原脱氯之间呈现正相关，即固氮生长促进还原脱氯反应。同时在Desulfovibrio dechloracetivorans SF3基因组中克隆到两种nifH基因同源体，这两种nifH基因在不同的生长代谢方式下呈现表达差异。这些现象的发现为我们理解微生物在重要遗传特性的协同进化和功能行使方面提供重要帮助，并为环境污染的原位修复治理开辟更广泛、更高效的途径。为深入探讨还原脱氯微生物的固氮分子机制和解释上述重要的发现，根据固氮代谢基因在基因组上呈簇分布的特征，我们构建了还原脱氯微生物基因组人工染色体文库（Bacterial artificial chromosome library），从该文库中筛选包含固氮酶基因簇（nif gene cluster）的克隆并测序，从序列水平剖析参与生物固氮过程中的功能基因和调节基因，从而为揭示还原脱氯微生物生物固氮的机理和调控机制提供可能。

全文目录


摘要  5-7
ABSTRACT  7-13
第1章 绪论(还原脱氯微生物生物固氮研究进展)  13-66
  1 厌氧微生物的还原脱氯  13-21
    1.1 引言  13
    1.2 厌氧脱氯微生物功能和系统发生的多样性  13-17
      1.2.1 厌氧生态系统中的脱氯  14
      1.2.2 有机氯代物作为唯一的碳源和能源  14-15
      1.2.3 还原脱氯微生物的脱氯机制  15-17
    1.3 还原脱氯微生物  17-19
    1.4 还原脱氯酶活性的调节  19-21
  2 生物固氮(biological nitrogen fixation)  21-51
    2.1 引言  21-22
    2.2 氮循坏  22-25
    2.3 生物固氮  25-51
      2.3.1 固氮的过程及参与固氮的基因  25-28
      2.3.2 固氮基因簇  28-29
      2.3.3 固氮酶  29-34
      2.3.4 固氮微生物  34-37
        2.3.4.1 自由生长的固氮微生物  34-35
        2.3.4.2 共生的固氮微生物  35-37
        2.3.4.3 互生的固氮微生物  37
      2.3.5 固氮活性的测定  37-39
        2.3.5.1 乙炔还原法  37-38
        2.3.5.2 ~(15)N同位素示踪法  38-39
      2.3.6 生物固氮的遗传调控  39-51
        2.3.6.1 生理学及遗传学调控  39-42
        2.3.6.2 NifA调控  42-43
        2.3.6.3 级联调控  43-45
        2.3.6.4 对氧的感应  45-47
        2.3.6.5 对氮源的调节  47-51
  3 还原脱氯微生物与生物固氮  51-53
    3.1 引言  51-52
    3.2 代表性的还原脱氯微生物  52-53
      3.2.1 Desulfomonile tiedjei DCB-1  52
      3.2.2 Desulfitobacterium dehalogenans  52-53
      3.2.3 Sulphurospirillum multivorans  53
      3.2.4 Desulfovibrio dechloracetivorans SF_3  53
  4 细菌人工染色体文库(BAC)  53-62
    4.1 人工染色体与载体的发展  54
    4.2 BAC载体结构与优点  54-57
    4.3 BAC文库的应用  57-62
      4.3.1 基因组物理图谱构建  57-59
      4.3.2 基因的图位克隆  59-60
      4.3.3 基因组测序  60-61
      4.3.4 BAC转基因研究  61
      4.3.5 BAC与比较基因组研究  61-62
  5 立题依据和意义  62-66
    5.1 本课题的研究意义  62-64
    5.2 本课题研究的技术路线  64-66
第2章 实验材料和方法  66-96
  1 实验材料  66-75
    1.1 还原脱氯菌株  66
    1.2 还原脱氯微生物的培养方式  66
    1.3 厌氧环境的维持  66-67
    1.4 菌株和质粒  67
    1.5 酶及生化试剂  67
    1.6 PCR引物  67-68
    1.7 母液及培养基的制备  68-75
      1.7.1 SF3培养基  69-71
      1.7.2 DCB-1培养基  71-72
      1.7.3 D.dehalogenans培养基  72-73
      1.7.4 S.multivorans培养基  73-74
      1.7.5 LB培养基  74
      1.7.6 SOC培养基  74-75
      1.7.7 BAC文库冷冻保存培养基  75
  2 实验方法  75-96
    2.1 nifH基因部分序列的克隆及测序  75-79
      2.1.1 基因组提取  75-76
      2.1.2 nifH基因保守序列的扩增及割胶回收  76-77
      2.1.3 nifH基因保守序列克隆及测序  77-79
    2.2 细菌总RNA抽提及逆转录PCR  79-82
      2.2.1 细菌总RNA抽提  79-80
      2.2.2 总RNA中微量DNA的消化  80-81
      2.2.3 逆转录PCR  81-82
    2.3 还原脱氯微生物生理活性的检测  82-84
      2.3.1 脱氯活性的检测  82-83
      2.3.2 其他呼吸代谢的监测  83
      2.3.3 固氮活性的检测(气相色谱)  83-84
      2.3.4 脱氯呼吸细菌的细胞产量  84
    2.4 DCB-1基因组nifH Southern杂交  84-86
      2.4.1 探针的标记  84-85
      2.4.2 基因组酶切,电泳及转膜  85-86
    2.5 DCB-1基因组BAC文库的构建  86-94
      2.5.1 DNA插入片段的制备  86-89
        2.5.1.1 高质量基因组DNA的制备  86-87
        2.5.1.2 最佳酶切条件的建立  87
        2.5.1.3 插入片段的制备  87-89
      2.5.2 BAC载体的制备  89-91
      2.5.3 高效感受态细胞的制备  91-92
      2.5.4 BAC载体与插入片段的连接及转化  92-93
      2.5.5 插入片段大小的鉴定  93
      2.5.6 文库的保存  93-94
    2.6 DCB-1固氮基因簇筛选及测序  94-96
      2.6.1 DCB-1固氮基因簇PCR筛选  94-95
      2.6.2 nifH阳性克隆的挑选及测序  95-96
第3章 还原脱氯微生物的生物固氮  96-114
  1 引言  96
  2 实验结果与分析  96-106
    2.1 nifH基因部分序列的克隆及测序  96-98
    2.2 NifH分子的系统发生分析  98-99
    2.3 氮气依赖生长及乙炔还原实验  99-106
      2.3.1 SF_3硫酸盐呼吸代谢的氮气依赖生长及乙炔还原实验  100-101
      2.3.2 SF_3还原脱氯呼吸代谢的氮气依赖生长及乙炔还原实验  101-102
      2.3.3 S.multivorans延胡索酸呼吸代谢的氮气依赖生长及乙炔还原实验  102-103
      2.3.4 S.multivorans还原脱氯呼吸代谢的氮气依赖生长及乙炔还原实验  103-105
      2.3.5 DCB-1硫酸盐呼吸代谢的氮气依赖生长  105-106
  2.4 生物固氮与还原脱氯  106-108
  2.5 还原脱氯微生物固氮在转录水平的检测  108-111
    2.5.1 SF_3两种nifH基因表达检测  109-110
    2.5.2 DCB-1 nifH基因表达检测  110-111
    2.5.3 S.multivorans nifH基因表达检测  111
  3 讨论  111-114
第4章 还原脱氯微生物DCB-1固氮基因簇的克隆  114-123
  1 引言  114
  2 实验结果与分析  114-120
    2.1 DCB-1 nifH基因Southern Blotting实验  114-115
    2.2 DCB-1基因组BAC文库的构建  115-120
      2.2.1 高质量DCB-1基因组制备  115-116
      2.2.2 DCB-1基因组不完全酶切及目的片段的回收  116-117
      2.2.3 BAC载体的制备  117-119
      2.2.4 连接、转化、鉴定及保存BAC文库  119
      2.2.5 nifH阳性克隆的PCR筛选、鉴定及测序  119-120
  3 讨论  120-123
参考文献  123-136
附录Ⅰ  136-137
附录Ⅱ  137-138
附录Ⅲ  138-139
攻读博士期间发表的论文  139
研究生期间获奖情况  139-140
致谢  140

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中图分类: > 生物科学 > 微生物学
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