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麻疯树水通道蛋白JcPIP2的分离、基因克隆及功能鉴定与调控分析

作　者: 张颖
导　师: 陈放
学　校: 四川大学
专　业: 植物学
关键词: 麻疯树 植物水通道蛋白 植物质膜内膜蛋白的分离 质谱鉴定 克隆 生物信息学分析 半定量RT-PCR Southern杂交 Northern杂交 Western杂交 功能鉴定 亚细胞定位 GFP标签 干旱胁迫 异源表达 磷酸化调控
分类号: Q943
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


麻疯树（Jatropha curcas L）是一种大戟科（Euphorbiaceae）的油料植物，广泛分布于热带和亚热带地区。它具有极强的抗旱性，甚至可以在沙漠地区正常生长。为了研究麻疯树抗旱性的分子机制，本实验分离了一个与抗旱密切相关的植物水通道蛋白JcPIP2并展开了功能研究。1、麻疯树JcPIP2蛋白的分离及基因克隆本文采用两相法从麻疯树幼苗组织中提取质膜囊泡组织，再进行质膜内膜蛋白的分离。在SDS—PAGE电泳下分离出一条分子量为29KDa的蛋白富集带。由于其与菠菜叶肉细胞分离出的质膜内膜蛋白富集带分子量相近，被选择进行质谱分析。将质谱分析所得的数据在NCBI的蛋白质数据库上进行鉴定，发现一条最长的属于植物PIP蛋白的肽段：NPYNHLLGGGANSVNTGYSK。根据该肽段结合麻疯树已有基因密码子的偏爱性设计简并引物进行麻疯树PIP基因的克隆。采用RT—PCR和RACE技术成功克隆了麻疯树JcPIP2基因。其cDNA全长为985 bp，包括一个843bp的完整的开放阅读框（ORF），39bp的5′-非翻译区片段和103bp的3′-非翻译区片段。GenBank登录号为：EF030420。以开放阅读框的cDNA序列两端设计引物进行DNA克隆得到一个长为1273bp的序列，与cDNA序列比较分析发现有3个内含子。JcPIP2基因的ORF编码280个氨基酸。2、生物信息学分析同源性分析表明JcPIP2和其它植物的PIP氨基酸序列间有很高的同源性，其中与蓖麻PIP的同源性最高（94％）。与已经鉴定出蛋白三维晶体结构的菠菜SoPM28A的同源性也高达86％。对蛋白疏水区和跨膜区进行预测表明该蛋白有六个跨膜区和5个亲水环，整个蛋白的疏水性很强属于典型的膜蛋白的特征。对JcPIP2蛋白质结构预测表明，JcPIP2的三级结构和菠菜PIP2的晶体结构极为相似，主要由6个跨膜的α—螺旋和5个亲水环（LoopA、B、C、D、E）连接，其中A、C、E环位于胞膜外侧，B、D环及氨基和羧基末端位于胞膜内侧。羧基端和氨基端有高度相似的氨基酸序列且纵向重复，多肽链的两端显示明显的对称性，每端（胞外的E环、胞内的B环上）由高度保守的天门冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸（Asn-Pro-Ala，NPA）组成一个小的结构域—-NPA基序，NPA基序高度保守。对JcPIP2蛋白的化学修饰位点进行预测发现该蛋白有5个磷酸化位点，为研究JcPIP2蛋白的磷酸化调控垫定了基础。3、Southern杂交用限制性内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ、SacⅠ和XpnⅠ将基因组DNA酶切消化，每种酶切产物至少可以产生2条杂交带，说明JcPIP2在麻疯树基因组中至少有2个以上拷贝。4、Northern及Western杂交麻疯树水通道蛋白JcPIP2广泛分布于麻疯树的各个组织。虽然其基因的表达和蛋白分布不是一一对应的关系，但都共同反映了JcPIP2广泛分布在麻疯树的各个组织。5、JcPIP2水通道蛋白功能的鉴定在异源表达系统非洲爪蟾卵母细胞中对JcPIP2蛋白的功能进行了鉴定，发现该基因编码一个功能的水通道蛋白。表达了JcPIP2基因的爪蟾卵母细胞的细胞质膜水通透性提高了10倍以上。6、JcPIP2蛋白的亚细胞定位为了研究JcPIP2的亚细胞定位情况，我们构建了JcPIP2-GFP融合基因，将其在异源表达系统非洲爪蟾卵母细胞中进行异源表达发现荧光信号只表现在细胞膜上，这说明麻疯树JcPIP2蛋白是一个膜蛋白，这一结论也与我们第一章质谱分析的结果相吻合。7、干旱胁迫下JcPIP2基因的表达及蛋白丰度的变化对JcPIP2在干旱胁迫条件下的基因表达和蛋白分布情况进行了研究表明，干旱胁迫下JcPIP2在基因表达量和蛋白含量上都有明显增加。8、JcPIP2蛋白的磷酸化调控位点分析通过构建磷酸化位点突变体，并在异源表达系统非洲爪蟾卵母细胞中进行检测发现JcPIP2蛋白有两个磷酸化调控位点Ser114和Ser273。说明JcPIP2蛋白活性受磷酸化调控。

全文目录


图片目录  7-9
中文摘要  9-12
英文摘要  12-15
第一章 麻疯树水通道蛋白JcPIP2的分离和基因克隆  15-53
  摘要  15-16
  1 引言  16
  2 材料与方法  16-31
    2.1 实验材料  16-17
    2.2 实验方法  17-31
      2.2.1 麻疯树幼苗质膜水通道蛋白JcPIP2的分离  17-19
      2.2.2 麻疯树幼苗质膜水通道蛋白基因JcPIP2的克隆  19-31
  3.结果与分析  31-47
    3.1 麻疯树幼苗质膜水通道蛋白JcPIP2的分离  31-32
      3.1.1 麻疯树幼苗质膜内膜蛋白的分离  31
      3.1.2 麻疯树幼苗质膜水通道蛋白的鉴定  31-32
    3.2 麻疯树总RNA和DNA的质量分析  32-33
    3.3 JcPIP2基因cDNA的克隆  33-36
      3.3.1 下游片段的获得  33
      3.3.2 上游片段的获得  33-34
      3.3.3 全长cDNA的获得  34-36
    3.4 JcPIP2基因DNA的克隆  36-37
    3.5 JcPIP2基因cDNA序列的分析  37
      3.5.1 编码区的序列分析  37
      3.5.2 3’-非翻译区的序列分析  37
    3.6 推测氨基酸的序列分析  37-47
      3.6.1 推测氨基酸的序列  37-38
      3.6.2 进化分析  38-41
      3.6.3 JcPIP2蛋白疏水区的预测  41-42
      3.6.4 JcPIP2蛋白跨膜区的预测  42
      3.6.5 JcPIP2蛋白修饰位点预测  42-44
      3.6.6 JcPIP2蛋白空间结构预测  44-47
  4 讨论  47-50
  小节  50-51
  参考文献  51-53
第二章 麻疯树水通道蛋白JcPIP2功能的鉴定与分析  53-75
  摘要  53
  1 引言  53-54
  2 材料与试剂  54-56
    2.1 实验材料  54-55
    2.2 实验试剂  55-56
  3 实验方法  56-66
    3.1 Southern杂交  56-59
    3.2 Northern杂交  59-60
    3.3 JcPIP2蛋白的水通道功能鉴定  60-64
    3.4 Western杂交  64-66
  4 结果与分析  66-70
    4.1 JcPIP2基因在植株体内的表达情况  66-67
    4.2 JcPIP2蛋白在植株体内的分布情况  67-68
    4.3 JcPIP2蛋白在异源表达系统非洲爪蟾卵母细胞中的亚细胞定位情况  68-69
    4.4 Sourthern Blot分析  69
    4.5 JcPIP2蛋白在异源表达系统Xenopus oocytes的功能分析  69-70
  5 讨论  70-71
  小结  71-72
  参考文献  72-75
第三章 麻疯树水通道蛋白JcPIP2的功能调控分析  75-85
  摘要  75
  1 引言  75-77
  2 材料与试剂  77
    2.1 材料  77
    2.2 试剂  77
  3 实验方法  77-78
    3.1 麻疯树幼苗的干旱胁迫  77-78
    3.2 Northern杂交  78
    3.3 Western杂交  78
    3.4 异源表达系统非洲爪蟾卵母细胞的分离、培养  78
    3.5 模板的制备和体外转录  78
  4 结果与分析  78-81
    4.1 JcPIP2蛋白水通道功能的磷酸化调控分析  78-80
    4.2 干旱胁迫下JcPIP2基因的表达情况  80
    4.3 干旱胁迫下JcPIP2蛋白的丰度变化情况  80-81
  5 讨论  81-82
  小结  82-83
  参考文献  83-85
文献综述  85-108
  植物水通道蛋白研究进展  85-108
    摘要  85-86
    前言  86-87
    1 植物水通道蛋白的分类及亚细胞定位  87-89
    2 植物水通道蛋白的结构  89-91
    3 植物水通道蛋白在植物体内的分布  91-92
    4 植物水通道蛋白的活性调控  92-95
      4.1 转录水平的调控  93
      4.2 转录后水平的调控  93-95
    5 植物水通道蛋白的选择透性  95-96
    6 水通道蛋白的功能  96-97
    7 植物水通道蛋白研究的方法学  97-101
      7.1 植物水通道蛋白的功能检测及研究  97-99
        7.1.1 非洲爪蟾卵母细胞(Xenopus oocyles)检测系统  97-98
        7.1.2 酵母(Pichia pastoris)检测系统  98
        7.1.3 基因敲除突变体和反义基因技术  98-99
      7.2 植物水通道蛋白的定位  99-101
        7.2.1 融合基因技术  99-100
        7.2.2 免疫定位技术  100
        7.2.3 原位杂交技术  100-101
    8 结语  101-103
    参考文献  103-108
致谢  108-109
在读期间发表及待发表论文情况  109
获奖情况  109-110

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中图分类: > 生物科学 > 植物学 > 植物细胞遗传学
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