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法医学降解检材DNA分析的新指标探索

作　者: 张海军
导　师: 侯一平
学　校: 四川大学
专　业: 法医学
关键词: STR miniSTR SNP 单碱基延伸 PCR内对照降解DNA 法医遗传学
分类号: D919
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

目的为了提高分析DNA高度降解样本的成功率，探索一些针对高度降解DNA分析的新方法、新指标十分必要。本课题旨在构建一些有利于分析高度降解DNA的方法，以弥补商品化STR复合扩增试剂盒在分析高度降解DNA的不足，增加法医学个人识别能力。方法从法医检案的实践中挑选出商品化STR复合扩增试剂盒DNA分析成功率最低的4个STR基因座，通过修改引物结合区的位置，减小扩增片段的长度，将其构建一个复合扩增荧光检测和自动化分型体系(miniSTR)。将miniSTR与商品化STR复合扩增试剂盒的分型结果进行一致性、抗降解和抗PCR抑制物能力比对实验，依据DNA分析技术工作组(TWGDAM)指南进行法医学可行性研究。选择5个单核苷酸多态性基因座(SNP)作为研究对象，3个(rs999842、rs922992、rs924181)定位于常染色体，一个(rs997262)定位于X染色体，一个(m9)位于Y染色体。将其构建成一个超短片段长度PCR复合扩增体系，利用多重单碱基延伸荧光检测方法进行分型，与构建的miniSTR进行抗降解和抗PCR抑制剂能力对比实验，并进行法医学可行性、群体遗传学和性别判断的研究。构建一个PCR内对照物，使其能与商品化STR复合扩增试剂盒一同扩增，一同电泳，一同自动化分型。通过观察内对照产物峰高情况，确定PCR反应中抑制物的存在和作用情况。结合案例进行法医学可行性评估。结果通过统计220份法医生物物证样本的DNA分型结果，发现商品化STR复合扩增试剂盒对D7S820、D18S51、CSF1P0、D2S1338、FGA五个基因座分型的成功率最低。由于FGA的核心重复基序的序列太长，无法将其扩增片段长度减小到理想的程度，不适合进行小片段STR设计。于是我们建立了一个含有D7S820、D18S51、CSF1P0和D2S1338共4个基因座的复合扩增荧光检测体系(miniSTR)。通过比对商业试剂盒Identifiler这4个基因座的分型结果、分析高度降解DNA的能力和抵抗PCR抑制物的作用，发现miniSTR分型结果与商业试剂盒Identifiler的结果相同；miniSTR比商业试剂盒更能从高度降解DNA中得到STR基因座分型结果，在PCR反应时，能从更高浓度的抑制物(血红蛋白)中得到分型结果。法医可行性研究结果显示，该复合扩增体系的灵敏度达到200pg，分型结果稳定，重复性好，能够对常见基质上的斑痕正确分型，具有较好的组织同一性和种属特异性。用于实际检案，可以提高DNA高度降解检材分型成功率。构建的5个SNP复合扩增体系，片段长度在60-70bp之间。应用多重引物单碱基延伸荧光检测技术进行分型。结果发现SNP比miniSTR从高度降解DNA中得到分型结果的成功率更高，并且能从含更高浓度抑制物(血红蛋白)的样本中得到分型。法医可行性研究显示，检验的最低模板量为100pg，分型结果稳定，重复性好，对法医常见生物检材，包括毛发、血痕、精斑、烟蒂等均获得正确结果，并且可以判断检材来源者的性别。通过分别对20名无关男性个体和20名无关女性个体分型，得出5个SNP的等位基因频率分布资料。所有常染色体SNP的杂合度均大于0．43，显示出良好的多态性。构建的PCR内对照物，所产生的片段大小为83bp，与商品化STR复合扩增试剂盒内标为同种荧光染料标记，能与商业试剂盒一同扩增、电泳分离及荧光检测，不影响商业试剂盒分型结果的准确性、灵敏度和种属特性等特征。可以通过观察内对照产物峰高情况，评估PCR反应中抑制物的存在和作用情况。为指导DNA提取和PCR扩增提供参考。结论本课题构建了一些有利于分析高度降解DNA的方法，弥补了商品化STR复合扩增试剂盒在分析高度降解DNA的不足。为法医高度降解检材的DNA分析提供了新方法和新指标。

全文目录

中文摘要  5-8
英文摘要  8-11
前言  11-12
第一部分  12-43
  材料与方法  13-18
  结果  18-37
  讨论  37-40
  结论  40-41
  参考文献  41-43
第二部分  43-74
  材料与方法  44-51
  结果  51-65
  讨论  65-70
  结论  70-71
  参考文献  71-74
第三部分  74-91
  材料与方法  75-78
  结果  78-86
  讨论  86-88
  结论  88-89
  参考文献  89-91
总结  91-92
文献综述  92-104
  参考文献  101-104
附录  104-123
研究生简历  123-125
致谢  125-126

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