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人骨保护素质粒转染抑制大鼠实验性牙周炎骨吸收的研究

作　者: 唐华
导　师: 宫苹
学　校: 四川大学
专　业: 口腔临床医学
关键词: 牙周炎骨保护素 OPG RANKL 骨吸收基因治疗
分类号: R781.4
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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引　用: 3次
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内容摘要

目的牙周炎是人类常见病、多发病，发病率高达80％以上，常导致牙周组织结构破坏，牙周附着丧失、牙周袋形成、牙齿松动甚至脱落，是导致成年人失牙的主要原因。与牙周炎发病过程极为类似的种植体周围炎也已成为影响牙种植远期成功率的一个主要因素，是口腔种植治疗的一个重大挑战。目前，临床上治疗牙周炎和种植体周围炎的方法仍是牙周基础治疗，同时配合全身或局部应用抗生素。当各种骨吸收刺激因子引起大量破骨细胞活化，牙槽骨发生显著吸收破坏如快速进展性牙周炎时，仅靠物理和化学治疗很难逆转牙槽骨迅速破坏趋势；并且目前尚无一种理想的促使被破坏和吸收的牙周（或种植体周）组织再生的方法，故在炎症初期抑制破骨细胞功能、减少牙槽骨吸收，这对治疗牙周炎、种植体周炎维持患牙、种植体功能显得尤为重要。新近发现的OPG/RANK/RANKL（osteoprotegerin/ receptor activator ot nuclear factor-κB/receptor activator of nuclear factor-κB ligand）系统，是骨组织重塑过程中的关键性调节因子，在破骨细胞分化和激活过程中必不可少。近年来，国内外学者利用OPG防治因破骨细胞过度活化而引起的骨吸收疾病做了大量研究，发现OPG可有效抑制骨质疏松性骨吸收、恶性肿瘤骨转移破坏等骨质吸收疾病。但目前应用OPG治疗牙周炎、种植体周炎鲜见报道，OPG生物治疗牙周炎骨吸收的研究尚未见报道。本研究构建质粒载体pcDNA3.1-h OPG，通过体外、体内转染，评价OPG直接基因转染疗法对大鼠实验性牙周炎牙槽骨吸收的影响，为牙周炎以及种植体周炎的生物治疗提供实验依据。方法（1）根据人OPG cDNA序列，设计合成二对特异性引物，运用PCR方法从MGC：29565克隆出人OPG基因片段，经双酶切后将其连接于真核表达载体pcDNA3.1（-）上。重组质粒在处于感受态的大肠杆菌DH5α中扩增，纯化，通过PCR鉴定阳性重组子及基因序列测定。（2）将重组质粒（μg）和脂质体Lipofectamine2000（μl）以1∶2、1∶2.5、1∶3比例混合，遵循脂质体转染步骤于体外转染小鼠肌源性细胞C2C12，寻求最佳转染效率；采用Western免疫印迹（Western blot）、逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）、细胞免疫组化方法检测转染后OPG基因、蛋白表达情况。（3）采用骨髓共培养法，将出生后10—12d大鼠长骨骨髓细胞在骨片（每组3个）上加入转染后3d的培养液上清与10^-7mol／l维生素D₃、10^-8mol／l地塞米松联合诱导培养。连续培养10d后将骨片做扫描电镜（SEM），观察实验组与对照组间骨吸收陷窝面积差异。（4）将30只SD大鼠随机分为3组，即Ⅰ组生理盐水组（n=10，100μg／只）、Ⅱ组pcDNA3.1（-）组（n=10，100μg／只）、Ⅲ组pcDNA3.1-hOPG组（n=10，100μg／只）。丝线结扎上颌第二磨牙、接种混合牙周炎可疑致病菌，喂以高糖软食，诱发实验性牙周炎，以对侧同名牙对照。结扎28d后处死，取得双侧上颌牙槽骨作为标本。检测指标：1、双侧上颌第二磨牙近远中釉牙骨质界到牙槽嵴顶间距离，计算牙槽骨吸收量。2、免疫组化观察比较牙槽骨吸收差异、OPG在牙周组织的表达、OPG／RANKL比值变化和破骨细胞数量。统计学处理组间分析采用单因素的方差分析，组内分析采用配对t检验。结果（1）重组质粒pcDNA3.1-h OPG中的h OPG序列插入正确。（2）重组质粒与脂质体混合转染C2C12细胞，1∶2、1∶2.5组可获得较高OPG蛋白表达量，1∶3组OPG表达下降；（3）1∶2比例混合转染C2C12细胞，OPG mRNA表达量是空白组的5.79×10³倍，表达显著增加；（4）SEM显示：OPG转染后细胞培养液上清诱导培养破骨细胞，骨片上陷窝数量、大小比对照组明显降低：（5）动物实验显示：Ⅲ组结扎侧OPG表达强度增加，OPG／RANKL比值升高（P＜0.05），牙槽骨吸收量显著降低（P＜0.05），活化破骨细胞数降低（P＜0.05）。结论（1）成功构建重组质粒载体pcDNA3.1-h OPG，能够有效表达OPG。（2）OPG重组质粒转染，上调OPG／RANKL表达比例，进而抑制破骨细胞分化和活性，明显减少破骨细胞数量，有效减缓实验性牙周炎引起的牙槽骨吸收破坏

全文目录

缩略词表  5-6
中文摘要  6-9
英文摘要  9-15
前言  15-18
第一部分实验重组质粒构建、鉴定  18-26
  1 材料和方法  18-22
  2 结果  22-24
  3 讨论  24-25
  结论  25-26
第二部分实验人骨保护素重组质粒体外转染鼠成肌细胞的研究  26-49
  1 材料和方法  26-39
  2 结果  39-45
  3 讨论  45-48
  结论  48-49
第三部分实验人骨保护素重组质粒转染抑制牙槽骨吸收的实验研究  49-63
  1 材料和方法  49-53
  2 结果  53-58
  3 讨论  58-62
  结论  62-63
全文总结  63-64
参考文献  64-71
综述  71-85
个人简历  85-86
致谢  86-87

人骨保护素质粒转染抑制大鼠实验性牙周炎骨吸收的研究

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