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基于纸片保存奶样的奶牛隐性乳腺炎诊断技术研究

作　者: 吴旧生
导　师: 周继勇；胡松华
学　校: 浙江大学
专　业: 微生物学
关键词: 金黄色葡萄球菌 蛋白含量 保存温度 奶牛 液态奶 乳腺炎 乳糖含量 体细胞计数 人工污染 特异性
分类号: S858.23
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


本文从奶牛隐性乳腺炎的流行病学、影响纸片保存奶样中乳糖、乳蛋白等生化指标测定的因素、纸片保存奶样中无乳链球菌、金黄色葡萄球菌的PCR检测方法及其适用性进行了探索、最后对牛奶蛋白的SDS-PAGE电泳在隐性乳腺炎诊断的应用作了探讨，并对各种方法与标准诊断方法进行了比较分析。对杭州等地4388份奶样体细胞计数值与季节、奶产量、泌乳周期、乳脂和脂蛋白等因素的关系进行了调查，利用限制性最大似然估计(REML)模型进行了分析，结果表明采样月份(F=8.83，p＜0.01)、日奶产量(F=212.12，p＜0.01)、胎次(F=16.86，p＜0.01)、乳脂率(F=71.87，p＜0.01)、乳蛋白(F=78.92，p＜0.01)等因素对奶样体细胞数均有显著影响。利用混合线性模型的最大似然估计(REML)方法建立了体细胞计数响应模型，该模型可以有效地预测体细胞数的变化规律。在此基础上利用Logistic回归模型分析了采样月份、胎次、泌乳周期和日产奶量等因素对隐性乳腺炎发病率的影响程度，建立了相应的预测模型，经共线性检验，模型预测值与原始数据吻合良好(p＞0.05)模型分析提示，每年的8-9月份体细胞水平显著升高(p＜0.05)。日产奶量在20-30kg，乳脂率在3.5-5.0％，蛋白含量在2.5-3.1％时奶牛隐性乳腺炎发病机率最低。纸片保存奶样中乳糖含量的变异系数略大于液态奶样，但乳糖水平无显著差异(t=0.389，p＞0.05)。保存期(F=1.004，p＞0.05)、保存温度(F=0.004，p＞0.05)对纸片保存奶样的乳糖水平没有显著影响，其乳糖含量仅受奶样本身体细胞数的影响(F=162.42，p＜0.01)。提示纸片保存奶样适用于进行牛奶乳糖指标的测定。纸片保存奶样的蛋白含量约为液态奶样的83.6％，其变异系数为4.41％。保存时间和预处理介质对纸片保存奶样蛋白含量有显著影响(p＜0.01)，并受牛奶体细胞数的影响(p＜0.05)。保存温度对其影响不显著(p=0.052)。保存时间和预处理介质对纸片保存奶样的蛋白水平有协同影响(p＜0.01)。初始值和保存1、2、4周的样品间均有统计学显著差异(p＜0.05)；随着时间的延长，样品中蛋白含量逐渐下降，DDW、Tris盐酸缓冲液预处理对纸片保存奶样蛋白水平均有显著影响，EDTA对测定结果没有显著影响(p＞0.05)。提示纸片保存奶样蛋白质含量稍有下降，但在1-4周内可以保持相对稳定。对人工污染无乳链球菌的纸片奶样进行复苏培养，结果表明，纸片预处理介质(p＜0.01)和保存期(p＜0.01)对纸片保存无乳链球菌复苏率有显著影响，而保存温度对结果的影响较小(p＞0.05)。纸片保存温度(p＜0.05)、预处理方法(p＜0.01)和保存期(p＜0.01)对金黄色葡萄球菌的培养成功率有显著影响。针对无乳链球菌16-23S rRNA基因间区序列的引物，可扩增出唯一的270bp的PCR产物，而对人工污染的金黄色葡萄球菌、停乳链球菌、乳房链球菌和大肠杆菌的液态奶和纸片保存样品均无扩增产物形成。该引物对无乳链球菌的PCR检测灵敏度为2×10~2cfu／ml，与液态奶的检出结果相似。预处理方法对PCR结果没有显著影响，所有处理均可获得满意的PCR结果。以细菌培养为参照，PCR诊断的敏感性为96.15％，特异性为98.60％，准确率为98.06％，可以有效地从纸片保存样品中检出无乳链球菌。金黄色葡萄球菌引物SAISR1和SAISR2可分别从纸片保存样品中扩增出约500bp和250bp的特异性PCR产物，而对人工污染无乳链球菌等奶牛隐性乳腺炎主要病原无特异性扩增。SAISR1和SAISR2对纸片样品的检测灵敏度分别为2×10~4CFU／mL和2×10~3CFU／mL；若采用聚丙烯酰胺凝胶电泳结合硝酸银染色，SAISR2的灵敏度可提高至2×10~1CFU／mL。纸片预处理介质对PCR结果没有显著影响。以细菌为标准，SAISR2的灵敏度为89.19％，特异性为98.08％，诊断准确率96.37％，可有效地从纸片保存奶样中检出金黄色葡萄球菌。利用SDS-PAGE研究了纸片保存奶样乳蛋白成分变化，分子量较小的成分得到较好的分离(R_f＞0.2)，呈现为独立的条带群。分子量较大的成分滞留在上样孔附近，迁移率很小(R_f＜0.2)。迁移率较大的成分主要形成R_f值在0.51(A)，0.62(B)，0.72(C)，0.78(D)，0.84(E)和0.98(F)等6个条带群，其中C、D和E三个条带群，可因奶样不同而呈现不同的亮度或缺少，经与HMT、SCC和主要病原菌分离培养等试验结果联合分析，C、D、E三个条带群与SCC(r=0.795，p＜0.01)、HMT(r=0.471，p＜0.01)和主要病原菌的存在(r=0.389，p＜0.01)有显著相关。与细菌分离培养对比，SDS-PAGE方法对隐性乳腺炎诊断的灵敏度为100％，特异性为55.56％，若将分离到凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)也计入病原菌，则SDS-PAGE的灵敏度为90％，特异性为70.59％，与细菌培养的结果高度一致(kappa=0.622，p＜0.05)，PAGE方法比常用的HMT方法具有更好的灵敏度和特异性，与SCC法相当。综上所述，纸片保存奶样的隐性乳腺炎诊断可以采用乳糖、蛋白成分分析和PCR检测等方法进行，其中以PCR方法的特异性较高，而以蛋白质成分分析的灵敏度最高。

全文目录


目录  4-10
图表索引  10-12
  表格索引  10
  图片索引  10-12
摘要  12-14
ABSTRACT  14-17
第一部分 文献综述  17-57
  第一章 前言  17-23
    1 奶牛隐性乳腺炎  17-18
    2 奶牛隐性乳腺炎的诊断方法  18-21
      2.1 基于体细胞数的诊断方法  18-19
      2.2 基于酶指标的诊断方法  19-20
      2.3 基于牛奶理化指标的诊断方法  20
      2.4 基于微生物学指标的诊断方法  20-21
      2.5 样品采集方法  21
    3 研究内容和总体思路  21-23
  第二章 奶牛隐性乳腺炎病原学研究进展  23-48
    1 金黄葡萄球菌毒素研究进展  23-32
      1.1 致热性超抗原家族(pyrogenic toxin superantigens family)  23-28
        1.1.1 肠毒素的分离提纯和分子结构特征  24
        1.1.2 肠毒素产生的分子遗传学分析  24-27
        1.1.3 肠毒素的免疫学活性  27-28
      1.2 溶血素和杀白细胞毒素  28-31
        1.2.1 α-溶血素  28-29
        1.2.2 β-溶血素  29-30
        1.2.3 γ-溶血素和PV杀白细胞素  30-31
      1.3 剥脱毒素  31-32
      1.4 凝固酶  32
    2 B群链球菌毒素研究进展  32-37
      2.1 β-溶血素/溶细胞素  33-34
      2.2 透明质酸酶  34-35
      2.3 C_(5a)肽酶  35
      2.4 CAMP因子  35-36
      2.5 其它毒力因子  36-37
        2.5.1 寡肽酶  36
        2.5.2 碳水化合物毒素  36
        2.5.3 从GBS基因组预测的细胞外毒素因子  36-37
    3 金黄色葡萄分子流行病学检测研究进展  37-42
      3.1 不进行DNA扩增的检测方法  37-39
        3.1.1 限制性内切酶分析  37
        3.1.2 大限制性酶分析  37-38
        3.1.3 选择限制性片段杂交  38
        3.1.4 质粒图谱和质粒限制性内切酶图谱  38-39
      3.2 金葡菌PCR检测技术研究进展  39-42
        3.2.1 金葡菌毒素相关基因的检测  39-40
        3.2.2 金黄色葡萄球菌特异性鉴别基因  40-41
        3.2.3 PCR技术应用于金葡菌检测新进展  41-42
    4 无乳链球菌分子流行病学检测研究进展  42-48
      4.1 GBS核糖体操纵子基因的PCR检测  42-43
      4.2 利用毒力基因进行鉴定  43
      4.3 RAPD技术  43-44
      4.4 染色体DNA的RFLP  44-46
        4.4.1 常规电泳  44
        4.4.2 PFGE  44-46
      4.5 GBS的核糖体分型  46
      4.6 利用插入序列鉴定GBS  46-48
  第三章 奶牛隐性乳腺炎对乳成份的影响  48-57
    1 牛奶体细胞数在隐性乳腺炎诊断中阈值的确定  48-49
    2 隐性乳腺炎对牛奶中酶活性的影响  49-53
      2.1 NAGase  49-50
      2.2 血纤维蛋白溶酶  50-51
      2.3 乳过氧化物酶  51-52
      2.4 过氧化氢酶  52
      2.5 β-葡萄糖苷酸酶  52
      2.6 脂酶  52
      2.7 磷酸酶  52-53
    3 牛奶电导率的改变  53-54
    4 急性时相反应蛋白  54
    5 炎症的其它指标  54-57
      5.1 三磷酸腺苷  54-55
      5.2 乳糖  55
      5.3 乳蛋白  55-57
第二部分 研究内容  57-114
  第四章 奶牛隐性乳腺炎的流行病学调查  57-71
    1 材料与方法  57-59
      1.1 调查对象  57
      1.2 奶样采集及有关资料收集  57-58
      1.3 体细胞计数及判断标准  58
      1.4 分析模型的建立及参数的筛选  58-59
    2 结果  59-69
      2.1 影响牛奶体细胞计数值的因素  59-61
      2.2 REML对体细胞计数值影响因素的剖分  61-62
      2.3 体细胞数估测模型的建立  62-63
      2.4 影响奶牛隐性乳腺炎发病率的因素  63-64
      2.5 季节变化对奶牛隐性乳腺炎发生率的影响及其预测模型的建立  64-66
      2.6 胎次对奶牛隐性乳腺炎发生率的影响及其预测模型的建立  66-67
      2.7 胎次、季节和泌乳阶段对隐性乳腺炎发生率的影响模型  67-68
      2.8 定量数据对奶牛隐性乳腺炎发病率模型的贡献率分析  68-69
    3.讨论  69-71
  第五章 保存温度及保存期对纸片保存奶样乳糖含量的影响  71-78
    1 材料与方法  71-73
      1.1 纸片的准备  71
      1.2 奶样采集  71
      1.3 纸片的预处理  71-72
      1.4 体细胞测定  72
      1.5 液态奶样乳糖测定  72
      1.6 纸片保存奶样乳糖测定  72
      1.7 数据统计分析  72-73
    2 结果  73-75
      2.1 纸片保存奶样体积及乳糖分析  73
      2.2 影响纸片保存奶样乳糖含量的因素  73
      2.3 温度对纸片保存奶样乳糖含量的影响  73-74
      2.4 纸片保存奶样乳糖浓度对奶牛隐性乳腺炎的诊断评价  74-75
    3 讨论  75-78
  第六章 保存温度、保存期及纸片预处理介质对纸片保存奶样蛋白含量的影响  78-86
    1 材料与方法  78-79
      1.1 纸片的准备  78
      1.2 奶样采集  78
      1.3 纸片的预处理  78
      1.4 体细胞测定  78-79
      1.5 蛋白质测定  79
        1.5.1 蛋白标准曲线的制作  79
        1.5.2 液态奶蛋白含量测定  79
        1.5.3 纸片保存奶样蛋白含量测定  79
      1.6 统计分析  79
    2 结果  79-84
      2.1 滤纸片保存奶样体积和奶蛋白分析  79-80
      2.2 影响纸片保存奶样蛋白含量的因素  80
      2.3 保存温度对纸片保存奶样蛋白含量的影响  80-81
      2.4 保存时间对纸片保存奶样蛋白含量的影响  81
      2.5 预处理介质对纸片保存奶样蛋白含量的影响  81-82
      2.6 纸片预处理介质与保存时间对纸片保存奶样蛋白含量的协同影响  82
      2.7 纸片保存奶样蛋白含量对奶牛隐性乳腺炎的诊断评价  82-84
    3 讨论  84-86
  第七章 纸片保存奶样中无乳链球菌的PCR检测方法研究  86-96
    1 材料与方法  86-88
      1.1 纸片的准备  86
      1.2 纸片的预处理  86
      1.3 奶样采集  86-87
      1.4 体细胞测定  87
      1.5 细菌培养及菌株  87
      1.6 纸片保存奶样中人工污染无乳链球菌的复苏试验  87
      1.7 细菌DNA的制备  87
      1.8 纸片保存样品的DNA制备  87-88
      1.9 敏感性试验和特异性试验样品的准备  88
      1.10 无乳链球菌的PCR扩增  88
      1.11 数据统计与分析  88
    2 结果  88-93
      2.1 纸片保存奶样的无乳链球菌的复苏试验  88-89
      2.2 引物的特异性  89-90
      2.3 纸片保存奶样的PCR检测的敏感性试验  90-91
      2.4 保存时间对纸片保存奶样无乳链球菌PCR检测的影响  91-92
      2.5 临床试验  92-93
    3 讨论  93-96
  第八章 纸片保存奶样中金黄色葡萄球菌的PCR检测研究  96-105
    1 材料与方法  96-98
      1.1 纸片的准备  96
      1.2 纸片的预处理  96
      1.3 奶样采集  96
      1.4 体细胞测定  96-97
      1.5 细菌培养及菌株  97
      1.6 纸片保存奶样中人工污染金黄色葡萄球菌的复苏试验  97
      1.7 细菌DNA的制备  97
      1.8 纸片保存样品的DNA制备  97
      1.9 敏感性试验和特异性试验样品的准备  97
      1.10 金黄色葡萄球菌的PCR扩增  97-98
      1.11 数据统计与分析  98
    2 结果  98-103
      2.1 纸片保存奶样中金黄色葡萄球菌的复苏试验  98-99
      2.2 引物的特异性  99-101
      2.3 纸片保存奶样的PCR检测的灵敏度试验  101-102
      2.4 保存时间对纸片保存奶样金黄色葡萄球菌PCR检测的影响  102
      2.5 临床试验  102-103
    3 讨论  103-105
  第九章 纸片保存奶样蛋白聚丙酰酰胺凝胶电泳在奶牛隐性乳腺炎诊断中的应用  105-113
    1 材料与方法  105-106
      1.1 奶样采集  105
      1.2 细菌分离培养与鉴定  105-106
      1.3 体细胞测定  106
      1.4 纸片保存奶样的预处理  106
      1.5 电泳及染色  106
      1.6 数据统计与分析  106
    2 结果  106-110
      2.1 奶样的体细胞测定和细菌分离鉴定结果  106-108
      2.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳对纸片保存奶样蛋白的分离  108-109
      2.3 纸片保存奶样蛋白SDS-PAGE电泳图谱对奶牛隐性乳腺炎的诊断评价  109-110
    3 讨论  110-113
  第十章 结论与创新点  113-114
    1 结论  113
    2 创新点  113-114
参考文献  114-131
附录A 本论文主要缩写词及中英文对照  131-132
附录B 常用试剂及溶液配制  132-135
附录C 博士期间的论文和科研成果  135-136
致谢  136

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