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人类泌尿系统肿瘤组织中肿瘤—睾丸抗原基因及蛋白的表达情况

作　者: 殷波
导　师: 孔垂泽
学　校: 中国医科大学
专　业: 外科学
关键词: 肿瘤-睾丸抗原 MAGE基因肾细胞癌膀胱移行性细胞癌泌尿系统肿瘤
分类号: R737.1
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

目的肿瘤相关抗原是指表达存在于肿瘤组织和正常组织的肿瘤抗原。从治疗的角度来讲，肿瘤相关抗原在肿瘤组织表达丰度越高，在正常组织表达越局限，针对这类抗原进行的免疫治疗效果越显著，其副作用也越小，以防止或减少肿瘤复发。因此具有显著组织表达限制性的肿瘤相关抗原成为疫苗研发的主要靶点，尤其是肿瘤睾丸抗原(cancer-testis antigens，CT)。CT抗原的特点是表达局限于肿瘤，睾丸，和/或胎盘及胎儿卵巢，在其他正常组织不表达或只有很微弱表达。近年来许多研究表明，CT抗原基因编码的肿瘤相关抗原在许多肿瘤组织中有较高的表达，同时在除睾丸和胎盘外的正常组织均不表达，是特异性免疫治疗的理想靶分子，因此CT抗原已成为多肽疫苗研发的最有希望的一类抗原。若能成功筛选出在人类泌尿系统肿瘤中高度表达且具有显著组织限制性的CT基因，可以选择其中高表达的2～3种基因用于联合DNA疫苗的研究。现在公认，两种以上的基因联合转染疫苗可以改进肿瘤的免疫治疗，有利于机体免疫系统针对不同的抗原表位的刺激产生有效的、广谱的保护性免疫反应。联合疫苗大大扩展了癌症疫苗的应用范围，是今后疫苗研究、治疗的发展方向。膀胱肿瘤是我国发病率最高的泌尿系统肿瘤，其中移行细胞癌约占90％。尽管大部分膀胱肿瘤可以通过手术得到治疗，然而膀胱癌的高复发率经常使病人感到沮丧。因此，如何有效的预防膀胱肿瘤的复发已成为泌尿外科迫切解决的重要问题。免疫治疗在膀胱癌的术后辅助治疗中占据着重要地位。肾癌也是泌尿系统常见的恶性肿瘤之一，发病率仅次于膀胱癌。目前，25～40％的肾癌为偶发肾癌，25～30％的病人在初次诊断时就已经发生了明显的转移，一些病人发生了亚临床转移。手术是治疗肾癌的主要方法，由于肾癌对放疗和化疗均不敏感，免疫治疗一直是公认的主要的的术后辅助治疗方法。肿瘤的特异性免疫治疗一直是肿瘤免疫治疗研究的热点，然而长期以来，引发这种特异性抗肿瘤免疫的肿瘤相关抗原却很少被克隆出来，使多肽疫苗的研发受到限制。而CT抗原的发现给膀胱移行细胞癌和肾透明细胞癌的临床免疫治疗带来了新的希望。本研究主要探讨人类泌尿系统肿瘤组织中肿瘤-睾丸抗原基因及蛋白产物的表达情况。本论文主要可分为三部分：①筛选出在人类泌尿系统肿瘤中高度表达且具有显著组织限制性的CT基因，即应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法对人肾透明细胞癌和膀胱移行细胞癌组织中cTAGE-1、cTAGE-2、MAGE-A1、MAGE-A3、MAGE-A12及NY-ESO-1等6种CT基因的表达情况进行检测；②进一步检测具有高表达率CT基因蛋白产物在泌尿系统肿瘤组织中的表达情况，即采用Western blot法检测上述组织中MAGE-A3蛋白的表达；③探讨CT基因及其蛋白产物的表达与泌尿系统肿瘤临床病理特性之间的关系。方法一、实验材料(一)标本选取我院2006年6月至2006年12月收治的肿瘤患者77例，均经病理证实。其中男性46例，女性31例，年龄21～88岁，平均56.7岁。其中肾透明细胞癌42例；膀胱移行细胞癌35例。对其中20例患者取距癌组织5cm以上的癌旁组织作为对照，其中肾癌14例，膀胱癌6例。新鲜肿瘤组织及癌旁组织被制成直径约5mm的组织块，在手术切除后10min内放入液氮中保存，之后置入-70℃深低温冰箱内保存。(二)主要试剂：1、RT-PCR实验(1)总RNA提取试剂(TRIzol Reagent)；(2)RT-PCR试剂盒。2、Western blot实验MAGE-A3鼠单克隆抗体(6C1)；考马斯亮蓝蛋白定量试剂盒；碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG；硝酸纤维素膜；琼脂糖；DNA电泳缓冲液(TBE)、十二烷基磺酸钠(SDS)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)等其他试剂。3、主要仪器设备UV1201型紫外分光光度计、PTC-100 TM型PCR扩增仪、HERMEL-2283 K型低温高速离心机、G：Box(SYNGENE)凝胶成像分析系统、电泳仪BIO-RAD POWER PAc 3000、半干转印仪BIO-RAD semidry Transfer System等。二、实验方法1、RT-PCR法检测mRNA，按说明书操作提取RNA，引物设计如下：cTAGE-1上游引物5′-GGAGACCTACCGAAAGCG-3′，下游引物5′-TCAGATGAAGGCCAACCC-3′；cTAGE-2上游引物5′-GGAGACCTACCGAAAGcG-3′，下游引物5′-TCAGATGAAGGCCAACCC-3′；MAGE-A1上游引物5′-GGAGCACCAAGGAGAAGA-3′，下游引物5′-TGATGGTAGTGGGAAAGG-3′；MAGE-A3上游引物5′-AGTCCGAGTTCCAAGCAG-3′，下游引物5′-GCAGGTGGCAAAGATGTA-3′：MAGE-A12上游引物5′-GGAAGATGGCTGAGTTGG-3′，下游引物5′-AGGCAGGTGACAAGGATG-3′；NY-ESO-1上游引物5′-GAGCCGCCTGCTTGAGTT-3′，下游引物5′-AGCACTGCGTGATCCACATC-3′；β-actin上游引物5′-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3′，下游引物5′-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3′。逆转录合成cDNA，聚合酶链反应，PCR产物电泳及检测，阳性标准为相应碱基对区出现明显条带影。2、Western blot法检测MAGE-A3蛋白，组织细胞匀浆和蛋白提取，蛋白定量电泳，转印，杂交及显色，实验结果经自动电泳凝胶成像分析采集。三、统计学方法采用SPSS 11.5软件包进行统计学处理，计数资料采用Fisher确切概率法或Pearson)χ~2检验法进行统计学分析结果1、膀胱移行细胞癌组织中CT基因mRNA的表达：35例膀胱移行细胞癌组织100％(35/35)至少表达6种CT基因中一种，6例癌旁组织表达均阴性。膀胱移行细胞癌组织中MAGE-A12表达最高，其次为MAGE-A1，cTAGE-1，MAGE-A3，cTAGE-2及NY-ESO-1，分别为69％(24/35)，60％(21/35)，57％(20/35)，54％(19/35)，51％(18/35)及46％(16/35)。肿瘤不同分期、不同分级之间6种CT基因的表达差异均无统计学意义(Fisher确切概率法，P>0.05)。2、肾透明细胞癌组织中CT基因mRNA的表达：42例肾透明细胞癌组织中100％(42/42)至少表达6种CT基因中一种，14例癌旁组织表达均阴性。肾透明细胞癌组织中MAGE-A12表达最高，其次为MAGE-A3，MAGE-A1，cTAGE-1，cTAGE-2及NY-ESO-1，分别为71％(30/42)，70％(29/42)，66％(28/42)，65％(27/42)，60％(25/42)及50％(20/42)。肿瘤不同分期、不同分级之间6种CT基因的表达差异均无统计学意义(Pearsonχ~2检验法，P>0.05)。3、膀胱移行细胞癌组织中MAGE-A3蛋白的表达：35例膀胱移行细胞癌组织中MAGE-A3蛋白表达的阳性率为45.7％(16/35)，10例癌旁组织表达均阴性。肿瘤不同分期、不同分级之间MAGE-A3蛋白的表达差异均无统计学意义(Fisher确切概率法，P>0.05)。结论1、本研究应用RT-PCR技术检测了35例膀胱移行细胞癌和42例肾透明细胞癌组织中6种CT基因mRNA的表达情况，发现阳性表达率相当高，而在癌旁正常组织不表达。其中MAGE-A12表达率最高，而且100％至少表达一种CT基因。2、本研究表明，肿瘤的不同分期间、不同分级间，CT基因mRNA的阳性表达的差异无显著性意义。3、本研究应用Western blot技术检测了35例膀胱移行细胞癌组织中MAGE-A3蛋白的表达情况，发现阳性表达率相当高，而在癌旁正常组织不表达。MAGE-A3蛋白的阳性表达与肿瘤的分期、分级无关。4、中国人膀胱移行细胞癌和肾透明细胞癌组织中6种CT基因mRNA高表达及膀胱移行细胞癌组织中MAGE-A3蛋白高表达，提示CT基因产物作为肿瘤特异性抗原诱导膀胱移行细胞癌和肾透明细胞癌进行特异性免疫治疗可能取得较好的疗效。而CT基因检测阳性的患者，可能就是以后适宜进行CT特异性免疫治疗的患者。

全文目录

一、摘要  5-15
  中文论著摘要  5-10
  英文论著摘要  10-15
二、英文缩略语  15-16
三、论文  16-40
  论文一、肿瘤-睾丸抗原基因在人类泌尿系统肿瘤组织中表达情况的实验研究  16-26
    前言  16
    材料与方法  16-19
    实验结果(附论文图表)  19-26
  论文二、膀胱移行细胞癌组织中MAGE-A1、MAGE-A3及MAGE-A12基因及蛋白的表达  26-35
    前言  26-27
    材料与方法  27-30
    实验结果(附论文图表)  30-35
  讨论  35-39
  结论  39-40
四、本研究创新性的自我评价  40-41
五、参考文献  41-44
六、附录  44-58
  综述  44-56
  在学期间科研成绩  56-57
  致谢  57-58
  个人简介  58

人类泌尿系统肿瘤组织中肿瘤—睾丸抗原基因及蛋白的表达情况

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