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重要病原菌检测基因芯片的研制

作　者: 金大智
导　师: 王升启
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 基因芯片肠道致病菌重要烈性致病菌多重PCR 酪胺信号放大技术
分类号: R346
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

[目的]致病菌引起的感染性疾病是近些年威胁人类健康和造成社会恐慌的主要因素，同时也是造成人类死亡的重要原因。而且，细菌性生物武器正日益受到恐怖组织的普遍重视，多起生物恐怖事件表明生物恐怖袭击已成为现实的威胁，这些传染病的暴发和流行构成了严重公共卫生，社会和经济问题。快速、灵敏、准确、特异地检测致病菌是有效预防感染性疾病发生和控制其迅速传播的前提和关键。本文的研究目的是建立针对多种常见肠道致病菌、重要烈性致病菌和潜在细菌性生物战剂的快速、准确、灵敏、高通量的基因芯片检测技术平台，为临床诊断、食品卫生监督、传染病防控及防生反恐等提供快速、有效的诊断手段。[方法]以16S rDNA和23S rDNA基因作为检测靶片段，选取十五种常见肠道致病菌作为基因芯片检测的靶细菌，设计和筛选通用性引物和特异性探针，优化两重PCR反应体系，并探讨核酸提取方法、引物不对称比例、镁离子浓度、退火温度、退火时间、杂交温度、杂交液成分等因素对基因芯片杂交的影响。以九种重要烈性致病菌的特异性基因作为靶序列，设计并筛选引物和特异性探针，优化六组两重PCR体系，并探讨引物不对称比例、镁离子浓度、dNTPs用量、DNA聚合酶用量、杂交温度、杂交液成分等因素对基因芯片杂交的影响；优化酪胺信号放大体系的反应条件，并将酪胺信号放大体系与末端标记法的灵敏度进行比较。在此基础上，确定两种基因芯片体系的cutoff值，评价两种方法的灵敏度、特异性和重复性等性能指标。[结果] 1．十五种肠道致病菌基因芯片检测方法的建立：本实验选取的靶致病菌为单核增生李斯特氏菌、副溶血性弧菌、空肠弯曲菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、金黄色葡萄球菌、肉毒梭菌、蜡样芽孢杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、产气荚膜梭菌、变形杆菌、布鲁氏菌、肠出血性大肠杆菌O157:H7、耶尔森氏菌和霍乱弧菌。确定了最合适的基因组DNA提取方法为直接煮沸法，成功构建了肉毒梭菌模板。最佳PCR扩增条件为：两对引物的荧光引物与非荧光引物的比例均为1:10，终浓度为16S-F1，0.05μmol／L、23S-F3，0.15μmol／L；16S-R1，0.5μmol／L、23S-R4，1.5μmol／L，Mg²⁺浓度为2.0mmol／L，退火温度为56℃，退火时间30s。最佳杂交条件为：杂交温度为50℃，杂交液成分为5×SSC、0.2％SDS、2.5％甲酰胺。86种致病菌参考菌株均得到正确结果。确定了每种致病菌对应探针的cutoff值。对单一致病菌检测的灵敏度为10³CFU／mL；对六种致病菌同时检测的灵敏度为10⁵CFU／mL。批间批内变异系数CV值均小于15％。对99例临床样本进行检测，与常规培养法相比，正确率达到80.8％，其中包括4例混合致病菌感染。2．九种重要烈性致病菌基因芯片检测方法的建立：本实验选取的靶致病菌及特异性基因为炭疽芽孢杆菌（pag）、鼠疫耶尔森氏菌（3a）、土拉杆菌（fopA）、布鲁氏杆菌（BCSP）、伤寒沙门氏菌（vipR）、大肠杆菌O157:H7（rfbE、fliC）、痢疾杆菌（ipaH）、霍乱弧菌（ctxA、LPSgt）、小肠结肠炎耶尔森氏菌（ail），LPSgt基因能够准确地区分霍乱弧菌O139和非O139；rfbE基因和fliC基因能够有效甄别O157与H7血清型，16S rDNA基因作为内对照。确定了3a和fliC、vipR和BCSP、pag和fopA、rfbE和16S、ctxA和ipaH、LPSgt和ail等六组两重PCR反应体系，建立了磁珠法富集和浓缩PCR产物。最佳杂交条件为：杂交温度为50℃，杂交液成分为5×SSC、0.2％SDS、2.5％甲酰胺。显色条件为：链酶亲和素HRP为1:1500稀释；TSA-Cy3为1:1000稀释，均在37℃下孵育30分钟。28种致病菌标准菌株均得到正确的检测结果。确定了每种致病菌对应探针的cutoff值。检测鼠疫杆菌、炭疽杆菌、霍乱弧菌O139、土拉杆菌、布鲁氏菌的灵敏度均为10³CFU／mL，比末端标记法灵敏度提高10倍。模拟污染样本的灵敏度为10⁴CFU／mL／0.1g。批间批内变异系数CV值均小于15％。对10例临床样本和20例双盲模拟样本进行检测，结果与常规培养法或双盲结果一致。[结论]本研究建立的十五种肠道致病菌基因芯片检测方法具有快速、准确、高通量等特点，重复性、特异性良好、灵敏度高，可作为食品安全检测、细菌分类学研究和临床诊断的初筛辅助工具。结合酪胺信号放大技术建立基因芯片检测方法能够快速、准确、特异、灵敏地鉴定九种重要烈性病原菌，并能对不同血清型进行甄别，该方法可为临床诊断、卫生监督、食品安全检测、传染病防控及防生反恐等提供快速、有效的诊断手段，对控制传染病疫情的暴发和应急预防等具有重要的实际意义，对提高我军的快速防御能力和水平方面具有重要的军事意义。

全文目录

中文摘要  5-7
英文摘要  7-11
英文缩写  11-12
引言  12-25
第一章肠道致病菌基因芯片检测技术研究  25-60
  一、材料与方法  25-33
  二、结果  33-51
  三、讨论  51-60
第二章九种重要病原菌基因芯片检测技术研究  60-102
  一、材料与方法  61-66
  二、结果  66-94
  三、讨论  94-102
结论  102-108
附件  108-109
致谢  109-110
个人简历  110-112
发表文章  112-126

重要病原菌检测基因芯片的研制

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